布鲁氏菌的检测方法

荧光偏振方法(Fluorescence polarisation assay， FPA)是以荧光素标记物作为示踪剂来检测抗原/抗体相互作用的一种简便技术，该方法属于同源性分析，分析物不需进行分离，因而该法简便快捷。FPA 诊断布鲁氏菌的特异性和敏感性几乎和竞争 ELISA (Competitive enzyme-linked immunosorbent assay，C-ELISA)相同，一次检测仅需15 min，即可完成上百份样品的检测，可应用于动物群体布鲁氏菌病的检疫、筛查和净化。FPA 检测方法在某些发达国家已经得到了大量应用，并经研制开发了商品化 FPA 检测试剂盒。

而我国对 FPA 检测方法的研究起步较晚，目前尚无商品化 FPA 检测试剂盒，进出口贸易中牛、羊布鲁氏菌病 FPA 检测方法均依赖于使用进口试剂盒，因此开发布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法有其现实意义。本研究使用异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的布鲁氏菌光滑型 LPS 的小分子片段脂多糖-O-链(O-polysaccharide，OPS) 作为抗原，通过对标记抗原、反应条件、结果判断标准等多方面条件的优化，建立敏感性和特异性良好的布鲁氏菌荧光偏振方法，为多种动物布病检测提供快速高通量的新技术手段。

材料与方法

一、材料

⒈菌种：猪布鲁氏菌 S2 菌株(CVCC 70502)由本实验室保存。

⒉实验用血清：布鲁氏菌病阳性血清国家标准品由本实验保存，布鲁氏菌病阴、阳性血清样本由本实验采集并保存。

⒊主要试剂和仪器： 布鲁氏菌荧光偏振试剂盒购自 Diachemix 公司；胰大豆肉汤(TSB)和胰大豆琼脂(TSA)购自美国BD公司；异硫氰酸荧光素(FITC)、表面活性剂脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)、三乙胺购自 Sigma 公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购自康为世纪公司。低温离心机购自 Sigma 公司；超声破碎仪购自新芝生物科技有限公司；Powerpac Universal 通用型电源购自美国 Bio-Rad 公司。

二、方法

⒈OPS 的提取及标记：

(1) OPS 提取。鉴定合格的 B. suis 2 株二级种子，大量培养并灭活，参照世界动物卫生组织(OIE)编著的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》提取 OPS。上清液置 100 倍蒸馏水透析过夜，用 PEG 8000 浓缩 40 倍，再次置于蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，分装成 2 mL/瓶冻干保存，此即提纯的 OPS。 (2) OPS 鉴定与标记。参照徐先栋等[13]改良的脂多糖快速银染方法对其进行银染。银染鉴定的 OPS进行标记，步骤如下：将4 mg OPS加入到2 mL 0.5% (体积比)的三乙胺溶液中，置 4 °C 超声处理 15 min，超声后加入 200 μL 100 mmol/L 的 EDTA 溶液，并用 10 μL 1 mol/L 的盐酸将溶液 pH 调为 5.0。取 20 mg FITC (异构体 I)溶解于 800 μL 0.25 mol/L 的硼酸溶液(pH 10.5)中，然后全部加入到 OPS 溶液中，继续超声处理 1 min。加入 1 mL 1.6%脱氧胆酸钠溶液，37 °C 搅拌孵育 18 h。4 °C、10 000×g 离心 30 min，浓缩，透析，将透析物用 PD-10 柱脱盐，收集所有 FITC-OPS 标记物，合并后再浓缩，透析，收集透析后产物 4 °C 保存，即为标记抗原原液。

⒉FPA 试剂盒条件优化：

(1) FPA 步骤。取反应板，将待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别加入到 ELISA 板中，20 μL/孔，其中阳性对照血清加 1 孔(孔 1)和阴性对照血清各加 3 孔 (孔 2、3、4)。加样过程要注意避免产生气泡。每孔加 180 μL 样品稀释液，充分混匀。室温下孵育反应板 3−5 min。读取每孔的空白值。每孔立即加入 10 μL 荧光标记抗原，充分混匀。室温下孵育反应板 3−5 min。读取每孔偏振值。

(2) 布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒阴、 阳性对照血清的制备。采用虎红平板凝集试验、试管凝集试验及补体结合试验检测临床牛。3 种方法均检测为阴性的牛作为制备阴性血清的候选牛。对 3 种方法均检测为阳性的牛进行强毒株 M28 免疫，当效价超过 800 IU/mL 时制备阳性血清。

(3) 布鲁氏菌荧光偏振试剂盒(FPA)标记抗原浓度及稀释液的选择。棋盘法分别采用阴性和阳性血清各两份，通过稀释抗原浓度与选用不同的样品稀释液确定该方法的抗原稀释浓度和最佳样品稀释液。

⒊临界值的确定：

取经虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验检测均为阳性的血清 148 份、阴性血清 155 份，测定偏振值。采用 SPSS17.0 软件对检测结果进行分析。使用非参数法构建 ROC 曲线，并以 Youden 指数最大的切点作为阴性和阳性判断的临界点，同时确定该试剂盒的敏感性和特异性。

⒋重复性试验及保存期试验：制作 3 批试剂盒 (分别命名为 201506、201507、201508)，使用由本实验室采集并保存的阳性血清测定试剂盒批内和批间的重复性。

⒌临床样本检验：将临床采集的 400 份样品分别使用本实验建立的 FPA 方法和进口 FPA 试剂盒进行检测，比较其差异性。