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杂化颗粒C18色谱柱和乙酸流动相进行肽的高载量研究三

2020.6.22

使用杂化颗粒C18色谱柱和乙酸流动相进行肽的高载量研究

基于此，CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈生成最佳峰形的流动相条件应该有所不同。为此，还使用10倍酸性的酸(1%HOAc)调节的流动相进行了分离。尽管中等浓度对于开发纯化工艺可能具有一定参考价值，但此处未对其进行评估。如图3所示，改变流动相组分后，CSH柱的峰形大大改善，但BEH柱的峰形变得更差。使用二者各自的最佳HOAc流动相时，BEH柱(0.1%HOAc)和CSH柱(1%HOAc)都能生成较窄的目标肽峰(半峰宽分别为0.5和0.6min)。为了参照，使用0.1%TFA作为离子对试剂进行了分离，如图3中右侧所示。在使用TFA时，CSH130 C₁₈上的目标肽峰宽为0.6min，BEH130 C₁₈上则为1.1min。无论选用哪种色谱柱填料，使用优化的HOAc流动相获得的肽目标峰都远远窄于TFA流动相。这些结果表明，乙酸流动相对于肽制备型分离更为实用。

较窄的目标肽峰往往伴随着更高的杂质分离度，从而有机会收集到纯度更高的流分。色谱柱填料和流动相添加剂对DFVGYGVKDFVGVGVK制备型上样量的影响如图4所示，其中重点显示了基线以及每种分离方法对目标峰中杂质的分离能力，这些杂质已通过MS确认。如前所述，HOAc流动相获得的目标峰更窄。图4还表明，使用HOAc流动相也在最大程度上减少了所监测杂质的共洗脱。此外，很明显可以看出，通过使用不同的流动相添加剂和两种不同的色谱柱填料，目标肽和杂质之间的色谱选择性发生了极大的变化。就此项载量研究筛选的参数而言，采用1%HOAc流动相的CSH柱提供的目标肽峰最窄，并且所监测杂质的共洗脱也最少。不过，使用BEH色谱柱和0.1%HOAc流动相也能获得与此相当的分离效果。具有不同选择性和最佳添加剂浓度的色谱柱填料将会有利于高难度制备型分离工艺的开发。

使用杂化颗粒C18色谱柱和乙酸流动相进行肽的高载量研究

以上我们仅对合成肽的中等制备型上样量(1mg)结果进行了讨论。图5所示为4mg肽上样得到的色谱图。这一上样量对应0.5g原料，对于较大的50mm内径色谱柱，这是非常高的单次进样生产率。从这些数据可以明显看出，CSH和BEH色谱柱都适合用于高上样量。值得注意的是，从半制备型(50μg)到制备型(4mg)，CSH色谱柱获得的峰形保持了惊人的一致。当需要在不消耗大量样品前提下开发分离方法时，这种高度可预测性可能会非常有用。

使用杂化颗粒C18色谱柱和乙酸流动相进行肽的高载量研究

结论
根据对分析型内径色谱柱进行的载量研究，5-μm BEH130 C₁₈和5-μm CSH130 C₁₈在使用含TFA或HOAc的流动相时均显示出有利于制备型肽分离的巨大潜力。BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈色谱柱都具备有益特性。在酸性条件下，CSH130 C₁₈与BEH130 C₁₈相比显示出更高的载样能力，并且通常能产生更窄的目标峰。因此，CSH130 C₁₈流分体积更少，这一特性对后续的纯化和去溶剂步骤可能会有帮助。BEH130 C₁₈则极适于中性/碱性pH环境下的制备分离，因其在此类条件下具有更长更高的温度稳定性。最后，CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈还各自表现出独特选择性，成为解决高难度杂质/目标肽分析问题的有效搭配。

比上述特性更引人注意的是，两种固定相分别在不同浓度的流动相添加剂下对制备级上样量的合成肽取得了最佳效果。使用优化的HOAc时取得的峰形最佳，比使用0.1%TFA效果更好。这意味着可以利用这些杂化颗粒C₁₈色谱柱简化纯化工艺，因为使用HOAc流动相可用更少的步骤即获得含有药用反离子的肽。

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