从培养细胞或组织中制备细胞核基质/中间纤维骨架结构实验

实验材料 细胞

试剂、试剂盒 Tritron X-100抽提缓冲液

仪器、耗材 电子显微镜

实验步骤

1. 在 4℃ 用 PBS 洗细胞一次。

2. 在 4℃ 用含 0.5% Tritron X-100 的细胞骨架缓冲液抽提细胞 3 到 5 分钟。直到消化步骤，每 107 个细胞最少要用 1 ml 缓冲液，以后减半。

3. 在 4℃ 用抽提缓冲液抽提细胞 3~5 分钟。这一步去除组蛋白 H1 和除中间纤维蛋白之外的细胞骨架蛋白。另外，这一步也可在 DNA 酶消化步骤（第 4 步）之后作，这样也不会引起超微结构的变化。

抽提缓冲液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

250 mmol/L 硫酸铵

300 mmol/L 蔗糖

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EDTA

4. 在含 0.5% Triton X-100 的消化缓冲液中用无 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色质 DNA 酶浓度为 200~400 单位/ml，32℃ 反应 30~50 分钟。

含 0.5% Triton X-100 的消化缓冲液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

300 mmol/L 蔗糖

50 mmol/L NaCl

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EGTA

5. 用抽提缓冲液清洗样品两次，每次 5 分钟。

6. （可选）样品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分钟。这一步能使可能形成核基质核心的 10 nm 纤丝分支显形（Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ（每种酶 400 单位/ml）代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纤丝保存的更好。

2 mol/L NaCl 缓冲液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

300 mmol/L 蔗糖

2 mol/L NaCl

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EGTA

7. 固定核基质以进行免疫荧光检测或电子显微镜检测。