基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法(2)
标本的保存
血清（浆）
HBV：分离出的血清（浆）如不立即提取核酸，保存于-20℃待检。
HCV：尽快分离血清(浆), 如不立即提取RNA， 保存于-20℃待检。
长期保存：吸取200µl血清，加20u RNasin（RNA酶抑制剂），保存于-70℃。
已发出结果报告的标本应及时转移至冰箱保存，并由专人负责管理，保存1-2周（时间长短根据报告单上的承诺而定）。
全血标本
全血标本如用于DNA提取，可4℃下短期保存（数天），时间长易降解，如用于RNA检测，应在取血后尽快提取RNA。
最好将DNA或RNA提取后，置-70℃保存。
痰
液化的痰标本如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。
处理后的棉拭子、体液、脓液如不立即用于核酸提取，可保存于-20℃。
组织
新鲜组织最好保存于50%乙醇中，具体方法：先用生理盐水将组织洗一次，切成小块，加入适量生理盐水，然后边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。
总而言之，标本的保存及适当的预处理对核酸模板的成功提取具有决定性作用。要强调的是，所有用于上述处理的容器如试管或离心管，均应在使用前压灭菌。
核酸的提取
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：
裂解细胞
去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。
沉淀核酸
纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质
(一)DNA提取的经典方法
DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。
说明：
回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。
沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。
70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在 70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。
TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl
1mmol/L EDTA pH 8.5或 8
RNA的提取
RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。 RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。
蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA时，关键要避免 RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。
1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备
塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。
玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。
DEPC 是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37℃浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。
所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无 RNase的玻璃器皿。
严格来说，所有溶液均应用0.1%DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。
2．RNA提取中RNase污染的控制
最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下 RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。
实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。
