实验分析方法--反相色谱的固定相的分类及使用
1.硅胶基质反相色谱固定相
反相高效液相色谱中使用的固定相大多是各种烃基硅烷的化学键合硅胶。烷基链长可以是C2、C4、C6、C8、C16、C18和C2等,最常用的是C18(又称ODS),即十八烷基硅烷键合硅胶。键合烷基的链长对键合相的样品负荷量、溶质的容量因子及其选择性有不同的影响,当烷基键合相表面浓度(mol/m2)相同时,随着烷基链长增加,碳含量成比例增加,溶质保留值增加。
199年, 某公司采用带有二丁基或异丙基等较大基团的卤代硅烷代替甲基鹵代烷进行表面硅烷化制备键合固定相,被称作SB技术。由于位阻效应,较大的疏水基团从空间上起到了保护硅胶表面的作用,可明显降低硅胶的水解作用,减少键合相的流失,固定相稳定使用pH值上限达到9.0以上。SB技术解决了C8、CN和Ph固定相,特别是CN固定相的稳定性问题。
有些硅烷键合相(如C8、C18)的生产厂家采用被称为“封尾”( endcapping)的工艺,使硅胶担体表面完全反应(硅烷化)。封尾包括键合固定相与小分子硅烷进行的后续反应,如三甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷或(不经常的)六甲基二硅氮烷。这种方法通过反应掉一些残余硅羟基,增加担体的覆盖率,以尽量减少与溶质发生不良作用。然而,封尾也并不能完全克服酸性硅胶担体的缺点,并且这些小分子的封尾基团在低pH值反相色谱的分离中极易从固定相上水解下来,使其在pH<3时抗干扰、耐用性不强,封尾的色谱柱在中等与高pH值(pH=6~9)时更稳定。
改变键合基团的性质,如在烷基键合相中引入极性基团掩蔽残留硅羟基,利用碱稳定的金属氧化物如ZrO2、TiO2、MgO等涂覆SiO2表面也能够提高固定相的稳定性,使其适用于更多的领域。此外,使用保护柱也可以对分析柱起到一定的保护作用。
2.高分子类型的反相色谱固定相
微球形交联聚苯乙烯树脂是目前使用较为广泛的高分子基质反相色谱固定相,这种树脂表面具有疏水特征,可以直接用作RPC固定相。另外,乙酸乙烯酯共聚物、带有C18烷基侧链的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化物、C18烷基键合的聚乙烯醇C18烷基衍生的交联聚苯乙烯以及苯基或烷基衍生的羟基化聚醚树脂等作为反相色谱固定相也有应用。
高分子类固定相可以在较宽的pH值(pH-2~12,甚至pH=1~14)范围内使用,在典型反相色谱流动相条件下(乙腈-水或甲醇-水溶液),色谱性能类似于硅胶基质的烷基键合固定相。
3.强极性化合物分离反相色谱固定相
在较强极性化合物反相色谱分离中,由于流动相有机溶剂的比例相对较低,固定相表画的烷基链会发生一定程度的收缩,使得化合物的保留时间不稳定或分离效果变差。 Waters公司采用三步反应制备了包埋氨基甲酸酯的C8、C10、C12、C14、C16和C18系列固定相, 其他公司等也采用低酸度的超纯硅胶微球为基质,制备了二异丙基基团侧链保护的包埋酰胺基团十四烷基键合固定相。极性基团的引入使得固定相的亲水性明显提高,能够在纯水作为流动相的条件下实现强极性化合物的分离,极性、离子型和强碱性化合物都能得到很好的分离。
4.全氟烷基键合固定相
近年来,有多家色谱公司制备了全氟代烷基键合硅胶色谱固定相。与传统烷基键合硅胶固定相比较,卤代化合物、芳香异构体和其他极性化合物的保留更强,洗脱顺序也发生了改变。与碳氢键相比,碳氟键的极性更强,在烷基固定相中引入氟会引起溶质-固定相作用的明显变化,使卤代化合物或其他极性化合物的保留更强,分离选择性也会发生变化。
碳氟的偶极作用和其较强的刚性结构导致的形状选择性使得全氟烷基键合固定相在分离含羟基、羧基、硝基和其他极性功能基化合物方面具有显著优势。功能基团在芳香环或其他刚性环上时选择性优势尤其明显。全氟烷基键合固定相可以应用于表面活性剂分析、超临界流体色谱、离子对分离等方面。
