DNA探针原位杂交的相关介绍

　　1、4—6微米切片，用防脱片胶（多聚赖氨酸）处理过的玻片贴附

　　2、56—60℃烤片2—16h

　　3、新鲜二甲苯脱蜡，10minX2（趁热脱蜡）

　　4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空气干燥

　　5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸馏水稀释，浓度为25μg/ml），37℃消化10—15min

　　6、弃去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空气干燥

　　7、加入20μl探针，加盖薄膜。（探针用预杂交液稀释，浓度为5μg/ml）。

　　8、95℃变性10—12min；立刻置于冰块上，防止复性。

　　9、37℃杂交16—20h

　　10、揭去薄膜，每张切片加入以下杂交后洗涤液：

　　>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次；

　　>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次；

　　>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次；

　　11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤，1minX3次

　　12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液，37℃孵育45—60min；

　　13、0.1MPBS浸洗，5minX3次

　　14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液，37℃孵育45—60min。

　　15、0.1MPBS浸洗，5minX3次

　　16、滴加NBT/BCIP显色6—16h，

　　17、双蒸水终止反应（37℃10min—2h），双蒸水浸洗，5minX2次

　　18、滴加核固红，30秒—5min；

　　19、双蒸水浸洗，5minX3次

　　20、脱水、透明、封片