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依赖核酸序列的扩增技术叙述

2021.5.12

  国内外的研究结果均表明,草莓组织中富含多糖等物质,分离优质核酸较困难,核酸巾的杂质影响taq DNA聚合酶的活性,从而影响PCR技术在草莓病毒检测中的应用。为了提高利用PCR技术草莓病毒检测的稳定性,国内外的学者在草莓核酸提取方法做了较多的研究,利用OIAGEN公司生产的植物RNA提取试剂盒(Plant RNeasv Kit)能够快速地(约1h)从草莓叶片中提取出较高质量的总RNA。但是这种试剂盒很贵,不适合用于大规模精细的研究应用。

  NASBA中主要是反转录反应和T7 RNA聚合酶合成RNA的反应。一般认为核酸中的多酚、多糖杂质对反转录酶的影响相对较小。对T7 RNA聚合酶受影响可能也较小.而且即使在有DNA污染或存在的情况下.同样具有较高的特异性和灵敏度。NASBA还具有高灵敏度的优点,与嵌套PCR(Nested PcR)灵敏度相近。因此,利用NASBA检测草莓植株中的病毒比利用PCR检测草莓植株中的病毒更为有利。在不涉及病毒含量的定性检测研究中。可以采用琼脂糖凝胶电泳来检测NASBA产物。

  NASBA技术不需要PCR仪,在一般实验室内即可完成,而灵敏度高于PCR,对DNA病毒、RNA病毒和类病毒都可以检测,在检测RNA病毒时不受模板中DNA的干扰。为了提高精度,还可以使用分子信标,一般将NASBA技术和分子信标结合称之为AmpliDet RNA。NASBA在检测果树病毒中最早应用于CTV的研究中,以叶片、树皮为试材皆可以稳定地进行检测。Vaskova等利用NASBA结合分子信标对SVBV进行了检测,灵敏度可达到lng(纳克)左右。此外,NASBA技术还被用于检测南芥菜花叶病毒、悬沟子环斑病毒、番茄黑环病毒和番茄环斑病毒、柑橘裂皮类病毒、柑橘类病毒IV的研究中。利用NASBA技术也可以同时检测多种病毒,如Klerks等同时检测马铃薯卷叶病毒和马铃薯病毒Y,Szemes等同时检测PVY的3个株系。

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