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分子检测标本的处理

2021.5.24

1. 细胞富集/选择 激光捕获纤维切割、FRCS分型、磁珠捕获可用于从组织或者标本中获得相同类型的细胞,提高分子检测的灵敏度和特异性。这些方法通常用于检测循环肿瘤细胞,以监测最小剩余疾病(MRD),或者检测母体血液中胎儿细胞。肿瘤细胞可采用特定的表面标志物从混合细胞中分离。细胞富集方法可通过以下方式实现:

    1)密度梯度离心分离外周血单克隆细胞(PBMCs)

    2)基于密度的细胞富集(淘洗)
    3)抗体富集(FACS、磁珠捕获)
    4)激光捕获微切割(LCM)
2. 病原体富集和浓缩方法 分子检测的灵敏度通常通过扩增实现,一般不需要标本的富集或浓缩。利用巢氏扩增能最大程度地提高分子检测的灵敏度,PCR中的富集也可指去除干扰抑制性物质的过程。在实验室中,标本病原体的富集利用重力和离心力来分离混合的血液、粘液、炎性物质或其他干扰分子学分析的碎片。特殊情况,实验室需要浓缩标本来富集病原体或游离的循环核酸进行扩增,可采用高速离心法或过滤法进行浓缩。
3. 核酸制备
    (1) 病毒核酸分离 病毒核酸的纯化有一定的挑战性,因为通常生物标本的病毒滴度较低,而蛋白或其他污染物较多。纯化方法应提供定量的核酸恢复,并完全去除污染物。很多生物原始材料含有丰富的RNase,因此纯化方法需要使用有效的RNase抑制剂。纯化方法包括:有机提取方法、目标捕获方法、硅技术法。如果临床标本,如粪便、血浆、尿液、脑脊液或其他体液,通常仅包含少量的细胞或病毒,应对标本进行浓缩,可通过离心、过滤、阳离子表面活性剂等方法实现。
    (2) 基因组DNA分离 动物、人类、酵母、细菌细胞裂解液中的DNA提取方法同组织标本DNA提取类似。不同的原始材料含有的不同特征可能会影响DNA分离,标本的破碎和裂解对组织标本DNA的释放也会造成一定的影响。破碎和裂解不完全会降低DNA产量。破碎通常采用裂解缓冲液,包括表面活性剂(破裂细胞膜)和蛋白酶(消化细胞或病原体中的蛋白)。有些细胞类型需要额外的处理才能有效裂解。利用注射器和细针使细胞或组织裂解液均一化。将裂解液通过0.9mm的针管可筛选高分子量DNA,加上无菌塑料注射器,至少5-10次,直到得到均一的裂解液。基因组DNA的提取方法很多,包括有机提取法、盐析法、氯化铯密度梯度、硅方法、离子交换法、滤纸法,其基本原理是包括原始材料的破碎和裂解,继而去除蛋白和其他污染物,最后恢复DNA。
    (3) RNA提取 RNA提取首先应使原始材料破碎和均质化,一般使用有机溶剂或强解离剂,防止内源性RNase的释放。但在破碎和均值化过程中或之前,RNA的表达可能会发生改变。对于准确的基因表达分析,应先稳定标本,需要添加RNase抑制剂。组织破碎和均值化方法包括定转子均质器、研磨珠、研钵、杵、旋转柱均质器等。RNA提取方法也很多,典型的方案是将几种技术结合使用,根据特定的RNA类型、纯度要求、每个标本的期望时间和成本、RNA是否需要保持完整选择特定的方案,具体包括酶消化、有机提取、强变性剂提取、乙醇和LiCl沉淀、CsCl和蔗糖密度梯度、阴离子交换层析、硅方法、寡核苷酸(dT)亲和层析等。


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