基于“实验设计”的临床酶学参考方法测量不确定度评定模型的建立（2）

3 示例

3.1 GGT参考方法测量程序

3.2 GGT催化活性参考方法测量主要影响因素
       临床酶学参考方法测量影响因素在行业已基本达成共识（见图1）。根据QUAM理论，将这些因素与实验室制定的GGT参考方法测量程序综合分析，认定GGT催化活性参考方法测量的主要不确定度来源为波长、温度、吸光度、pH、反应液浓度、试剂批号、样本体积分数、时间、反应液的挥发、试剂衰变、线性、测量结果变异共12个主要变异因素。
3.3 各因素对临床酶学参考方法测量不确定度影响量的评定
3.3.1 波长对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定
3.3.1.1 评定方法
       为客观评价波长对GGT参考方法测量不确定度的影响量，设计一组基于GGT参考方法测量的实验。采用能覆盖参考方法测量范围的低、中、高3个浓度水平的血清样本为实验对象，分别观察波长为408.5nm、410nm、411.5nm时3个浓度水平的血清酶活性变化，采用曲线拟合的方法计算波长与GGT催化活性的函数关系，据此计算波长对GGT催化活性参考方法测量影响的灵敏系数。在此基础上，根据GUM原理评定波长引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。
3.3.1.2 评定实验
       A 实验名称：波长对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响。
       B 实验目的：评定波长对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响量。
       C 实验方法：
a) 制备能覆盖测量范围的低、中和高三个浓度的混合血清。
b) 基于IFCC参考方法进行试验。将测量波长设定为变量，其它参数等同IFCC参考方法。分别在408.5nm、410nm、411.5nm进行三个血清样本GGT催化活性浓度的测量。
c) 将各血清测量结果录入表1，统计结果录入表2。
d) 建立波长与GGT催化活性浓度变化的函数关系，绘制波长与GGT催化活性浓度测量结果相关关系图（图4）。
e) 计算波长变化对GGT测量影响的灵敏系数。
f) 根据GUM原理评定波长引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。
D 实验结果：
a）各浓度血清测量结果见表1。

b）各浓度血清数据处理结果见表2。

c）GGT催化活性浓度与波长的关系：见图4。

d) 波长对GGT测量影响灵敏系数的计算：
       根据波长对GGT催化活性浓度影响的函数关系：Y=-0.02X2+14.92X-2282.56，知波长每变化1nm，相应GGT催化活性浓度变化3.32%（灵敏系数）。
e）波长变化对GGT催化活性浓度测量不确定度影响量的评定根据IFCC—GGT催化活性测量参考方法文件要求，GGT测量波长变化不能超过1nm,但是由于GGT测量受波长影响明显，因此实验室标准操作规程规定波长漂移不能大于0.2nm。假定波长变化引起的GGT测量结果的变化为矩形分布，该输入量对GGT催化活性浓度测量引入的标准不确定度为乘以波长变化对GGT测量影响的灵敏系数，即下式：
波长（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度
= 。
E 实验结论
       波长变化（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.33%。
3.3.1.3 评定结果
       波长对GGT催化活性参考测量影响的相对标准不确定度为0.33%。
3.3.2 温度对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定
3.3.2.1 评定方法
       为客观评价温度对GGT参考方法测量不确定度的影响量，设计一组基于GGT参考方法测量的实验。采用能覆盖参考方法测量范围的低、中、高4个浓度水平的血清样本为实验对象，分别观察比色杯内温度为36℃、37℃、38℃时4个浓度水平的血清酶活性变化，采用曲线拟合的方法计算温度与GGT催化活性的函数关系，据此计算温度对GGT催化活性参考方法测量影响的灵敏系数。在此基础上，根据GUM原理评定温度引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。
3.3.2.2 评定实验
       A 实验名称：温度变化对GGT测量不确定度的影响。
       B 实验目的：评定温度变化对GGT催化活性参考方法测量不确定度的影响量。
       C 实验方法：
a) 制备能覆盖测量范围的低、中和高四个浓度的混合血清。
b) 基于IFCC参考方法进行试验。将测量温度设定为变量，其它参数等同IFCC参考方法。分别在36℃、37℃、38℃进行四个血清样本GGT催化活性浓度的测量。
c) 将各血清测量结果录入表3，统计结果录入表4。
d) 建立温度与GGT催化活性浓度变化的函数关系，绘制温度与GGT催化活性浓度测量结果相关关系图（图5）。
e) 计算温度变化对GGT测量影响的灵敏系数。
f) 根据GUM原理评定温度引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度。
D 实验结果：
a)各浓度血清测量结果见表3。

b) 各浓度血清数据处理结果见表4。

c) GGT催化活性浓度与温度的关系见图5。

d) 温度对GGT测量影响灵敏系数的计算
       根据温度变化对GGT 催化活性浓度影响的函数关系：Y=3.200X-18.533，知温度每变化1℃，相应GGT催化活性浓度变化3.20%（灵敏系数）。
e）温度变化对GGT测量不确定度影响量的评定
       根据IFCC—GGT催化活性测量参考方法文件要求，GGT测量温度变化不超过0.1℃。假定温度变化引起的GGT测量结果的变化为矩形分布，该输入量对GGT催化活性浓度测量引入的标准不确定度为乘以温度变化对GGT测量影响的灵敏系数，即下式：
温度（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度
= 。
E 实验结论
       温度变化（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.18%。
3.3.2.4 评定结果
       温度变化（输入量）引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度为0.18%。
3.3.3 其它因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定
       pH、吸光度等其它因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定可参照波长和温度因素对GGT参考方法测量不确定度影响量的评定方法进行。
3.4 主要变异因素对GGT催化活性参考方法测量不确定度影响量
       将基于“实验设计”方法获得的各主要变异因素对GGT催化活性参考方法测量的灵敏系数按GUM理论进行不确定度分量的评定，结果列于表5。

注：表中C为correction factor（经灵敏系数纠正后的校正因子）

3.5 标准不确定度的合成
3.5.1 合成与计算方法
       合成标准不确定度是个估计的标准差，是合理赋予被测量Y之值的表征其分散性的参数，根据不确定度传播律（鉴于酶学测量的特殊性， 此处不确定度传播律可简化为估计值的合成方差为，指输入量彼此独立或不相关的线性函数，不包括非线性函数的高阶项），将每一影响因素按独立因素进行合成，相对合成标准不确定度计算公式如下：

合成标准不确定度计算公式如下：

3.5.2 合成标准不确定度计算：
       以GGT为例，实验室测量GGT催化活性浓度的不确定度来源有12个：波长、吸光度、pH、温度、反应液浓度、试剂批号、样本体积分数、时间、蒸发、试剂衰变、测量线性和实验室测量结果变异，以上12个输入量引起的GGT催化活性浓度测量的相对标准不确定度分别为0.33%、0.17%、0.13%、0.18%、0.31%、0.87%、0.22%、0.02%、0.06%、0.29%、0.10%、0.50%，相对合成标准不确定度计算如下:

GGT的测量均值为124.5U/L，其合成标准不确定度为：

3.6 扩展不确定度计算
3.6.1 计算方法的选择：
       扩展不确定度计算方法有二种：U=k X uc (y)或Up=kp X uc (y)，其中U/Up为扩展不确定度，k/kp 为包含因子，uc (y)为合成标准不确定度。
       假定Y值的分布为正态分布，当Veff(合成标准不确定度的自由度，即有效自由度，公式为时，应使用U=k X uc (y)的计算方法，包含因子K选择2o对U 的估计，其置信概率近似为95%，此种计算方法可包含测量结果预估值的大部分。
       当Veff 小于6时，应选择Up=kp X uc (y)的计算方法，即依据置信概率p（双侧）的t 分布临界值和公式kp=tp X (Veff)，求出相应的包含因子k值，一般采用的p值为99%或95%，多数情况下选择95%。
3.6.2 计算
       124.5U/L GGT样本的扩展不确定度：

4 GGT催化活性参考方法测量不确定度评定模型 

其中f0为GGT催化活性参考方法测量过程中影响测量结果的恒定分量的影响函数：

5 小结
       本文建立的临床酶学参考方法测量不确定度评定模型从理论上与GUM和QUAM评定不确定度的方法一致。本法基于“实验设计”方法评定测量不确定度分量，采用“module”方式评定测量结果的不确定度，可操作性强。

参考文献
【1】 BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML. Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM)[M]. lst edition.Switzerland：International Organization for Standardization，1995.
【2】 EURACHEM/CITAC. Quantifying uncertainty in analytical measurement(QUAM)[M].2nd edition. EURACHEM/CITAC.2000.
【3】 刘文卿.实验设计【M】. 第2版.北京：清华大学出版社，2005：1-48.