把色谱柱加热到80℃会发生什么？
把色谱柱加热到80℃会发生什么？
Espresso系列
～第二弹～
大家有没有想过，把一支色谱柱加热到80℃会发生什么。。。为了好奇的同学们，YoYo老师今天将为大家带来Espresso系列第二弹～
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PS: Espresso系列是由大阪曹達日本实验室提供的干货数据，不定期更新嗷～
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Proteonavi S5的溶出行为2 & 3
～与他社色谱柱的比较及柱温80℃下的耐久性及峰形考察～
Keywords :Proteonavi, 肽类, 缓激肽, 后叶催产素, 血管紧缩素II, 神经降压素, 血管紧缩素I, 环孢菌素A, 表面活性肽, 0.1 vol% HCOOH, 柱温80℃, 耐久性, 峰形
～与他社色谱柱的比较～
ProteonaviS5是一款以孔径为30 nm的硅胶作为基材、键合C4基团的蛋白质・肽类化合物分析色谱柱。
上回的Espresso中介绍了以6种蛋白质作为样品，将Proteonavi S5与他社色谱柱进行溶出行为的比较的试验。（Proteonavi S5的溶出行为1～与他社色谱柱的比较～）
本次，我们以5种肽类化合物（缓激肽、后叶催产素、血管紧缩素II、神经降压素及血管紧缩素I）作为样品，将Proteonavi S5与一款填料表面带有正电荷的他社杂化型色谱柱（孔径13 nm、粒径3.5 μm）的溶出行为进行比较，所得结果见图1。
▲图1 两款色谱柱分析所得色谱图
其中，流动相条件为添加0.1 vol%甲酸的水-乙腈系统，在梯度条件下进行分析，对这两款色谱柱进行了溶出行为的考察。
如图1，他社色谱柱对5种肽类化合物的整体保留较弱，且缓激肽峰未能得到确认（被吸附而未能溶出）；与此相对，Proteonavi S5对这5种肽类化合物均得到了良好的色谱峰形及充分的保留与分离。
～柱温与溶出行为～
对肽类化合物进行分析时，有提高柱温的做法。例如，《第17改正日本药局方》中，环孢菌素是在柱温80 ℃附近的一定温度下进行分析的。
在此，以环孢菌素A作为原料，在等度条件下对色谱柱柱温变化及相应的溶出行为进行了考察。图2为所得结果。
环孢菌素A (M.W. 1202.6)
Cyclosporin A
▲图2 柱温与环孢菌素A溶出行为的关系
如图2，随着柱温的上升，环孢菌素A的保留逐渐减弱，峰形也愈发尖锐。
一般，与小分子相比，大分子的扩散速度较慢，因此色谱峰形有展宽的趋势，而设定较高的柱温可以使峰形变得尖锐。
就像这样，常规情况下，在对肽类化合物进行分析时，设定较高柱温可以使分析时间缩短，并提高定量准确性。（敲黑板！）
～80℃下的耐久性考察～
接下来，在柱温80 ℃条件下对Proteonavi S5的耐久性进行了考察。
图3为首次进样与连续进样第500针所得色谱图，图4为进样500针的环孢菌素A保留时间维持率（％）。
▲图3 首次进样和连续500次进样所得色谱图
▲图4 环孢菌素A的保留时间维持率（％）
如图3、4，对Proteonavi S5进行80˚C条件下的连续耐久性试验，在连续500次进样过程中（通液时间共计250小时），环孢菌素A的峰形几乎没有变化（理论塔板数N及对称因子S），同时，保留时间维持率近乎100%（首次进样与第500次进样对比，具体数值为99.4%）。
综上，Proteonavi S5色谱柱即使在80 ℃的高柱温条件下也能得到非常稳定的分析结果。
*耐久性评价方法是将首次进样的保留时间视为100%，将连续进样第500次的保留时间与其对比，计算维持率（%）。
*理论塔板数、对称因子的计算方法根据《第17改正日本药局方 解说书》进行。
对于环孢菌素A这样的大分子化合物，随着柱温的上升，其扩散速度加快，因而峰形会更尖锐。
进一步，针对提高柱温的效果，以环状肽类化合物表面活性肽（M.W. 1036.3）作为分析对象，将柱温分别设定为40 ℃和80 ℃进行分析，图5为分析所得结果。
表面活性肽 (M.W. 1036.3)
Surfactin
▲图5 柱温40 ℃及80 ℃条件下
对表面活性肽的分析色谱图
如图5，将柱温由40 ℃提高到80 ℃，表面活性肽在保留变弱的同时，峰形更尖锐，理论塔板数亦提高了1400。
综上所述，在对肽类化合物进行分析时，在高柱温条件下使用耐久性良好的Proteonavi S5色谱柱进行分析，提高柱温是获得尖锐峰形的技巧之一；在缩短分析时间的同时，检测灵敏度和定量准确性也能得到提高。
同学们都记住了吗～
【本集剧情回顾】
通过提高柱温可以达到改善峰形、提高理论塔板数的效果。
大阪曹達Proteonavi S5在柱温80˚C条件下可以稳定使用。
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