xCELLigence系统实时评测内源性G-偶联蛋白受体（GPCRs）功能

Jeff Irelan 美国圣地亚哥ACEA Biosciences 公司
Jonathan H. Morgan 美国弗吉尼亚州Manassas ATCC 产品经理

前言

    G-偶联蛋白受体（GPCRs），即 7-跨膜蛋白，是当今临床与科研药物的单一治疗靶点，也是迄今发现最大的靶点家族。据推测人基因组中，该家族的功能成员超过300个，涉及多种不同细胞与组织间的广泛信号途径。研究证实，对GPCR功能的调节，有助于免疫学、神经病学、心脏病学与肿瘤学领域多种疾病的治疗。
通过应用新的基于细胞水平的受体功能检测技术，候选药物对新调节子的确认率显著提高，损耗率（定义为临床前检测/临床试验失败率）降低。但基础研究获得的GPCR 功能数据很难被应用于临床疾病中。造成这种情况的原因是，传统细胞学实验往往（1）使用异源细胞，或相关性较低的细胞类型，进行人造受体的过表达；（2） 使用外源性检测试剂，如荧光标记试剂；（3）使用侵入性处理手段，像染料负载以及细胞裂解，（4）生成的数据仅为单一时间点的数据，而不是持续性细胞监测数据。
    最近开发的生物相关性程度更高的实验系统，可显著改善 GPCR 药物开发与研究应用的成功率(1)。罗氏应用科学部的 xCELLigence 系统，不需要使用外源性标记，即可对疾病相关细胞的内源性GPCR功能进行实时评测。将细胞接种于含有微电极的培养板上，可对GPCR 激活导致的细胞骨架结构的微小变化与细胞收缩情况进行准确测定。
    通过与细胞浆鸟嘌呤核苷结合蛋白或 G 蛋白结合偶联，GPCRs 可进行细胞的信号传导活动。所有主要的与 G 蛋白偶联的第二信使通路，都已被发现会激活环化AMP/蛋白激酶 A、钙离子/磷酸酶 C、β-抑制蛋白/MAPK，以及 Rho 家族 GTP酶，使细胞发生形态学改变。而xCELLigence 系统可通过记录细胞阻抗，很容易对形态学改变进行检测(2)，从而完成对GPCR的检测。
    与传统检测方法相比，形态学阻抗测定可对多个信号途径累积效应进行捕获。内源性GPCR 功能测定的优势包括（1）对靶受体进行评价是在其正常表达水平上；（2）在调节因子包括激素或异源性二聚体存在情况下，对受体之间的天然相互作用情况进行分析；（3）允许 GPCR 与细胞内 G 蛋白的天然偶联。同时，应用实时无标记xCELLigence 检测系统，可动态实时地记录实验期间的所有阻抗信息，从而对所有GPCR的反应进行检测。通过单一检测即可对 GPCR 激活导致的所有第二信使途径进行测定，从而有效降低试剂成本。
本研究中，我们发现 xCELLigence 系统是一种灵敏的、可靠的检测系统，用于持续内源性 GPCR 功能测定。研究中我们对涉及 24 个治疗相关受体家族的一组 43 个配体（参见表 1）进行了测定，并生成了相关GPCR功能图谱。实验涉及通用的肿瘤细胞系、HeLa、U2OS、SH-SY5Y 与 CHO-K1，以及疾病相关的原代细胞：人血管内皮细胞与混合肾上皮细胞。

表 1：GPCR 功能图概述