微流控扩散技术-膜蛋白研究新方法
背景
膜蛋白是生物膜功能的主要执行者，在生物体内参与许多重要的生理过程。但是，由于很难获得稳定均匀且维持膜蛋白正确构象的膜模拟环境，膜蛋白研究远远滞后于水溶性蛋白。磷脂纳米盘（Nanodisc）是由高密度脂蛋白发展而来的用于膜蛋白研究的新类型膜结构。将膜蛋白与Nanodisc组装起来，是膜蛋白研究的有效方法。制备纳米盘的一种常用方法是将苯乙烯-马来酸(SMA)添加到完整的细胞膜上，从而自发地生成SMA-脂质颗粒（SMALP）的纳米盘1。
微流体扩散分级(MDS)使用微流控分析芯片将蛋白质样本送入一个通道，在这个通道中，蛋白质样本与辅助流体一起以稳定的层流状态流动，没有混合。蛋白质从一个流层转移到另一个流层的唯一途径是扩散，扩散的速率与蛋白质的大小流体动力学半径Rh成正比。Rh的改变表明分子结合事件的发生。
摘要
在本应用中采用MDS技术的Fluidity one-W检测到了SMALP纳米盘的形成，而且揭示了SMA与脂质体的比例是如何影响SMALP纳米盘的大小，这是表征嵌入膜蛋白的一个关键参数。
低SMA/脂质体比例下，SMALP纳米盘开始形成。随着SMA/脂质体比例的升高，单层囊泡开始降解，大的异质性SMALP逐渐形成。在更高的SMA/脂质体比例下，SMALPs的平均流体动力学半径（Rh）缩小了4.5倍，这使得其内嵌的脂质大大减少了。
纳米盘这种大小变化极大地改变了内嵌膜蛋白周围的环境，因此在生物物理和生化应用中需要加以考虑。
因此，对于研究或使用SMALPs，以根据实验需求调整SMALP大小的研究人员来说，Fluidity one-W是一个理想的工具。
方法
1.制备荧光标记的脂囊泡
1-棕榈酰基-2-油酰-SN-甘油-3-磷酰胆碱(POPC)和1-棕榈酰-2-(二吡啶甲基硼二氟)十一烷基酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱(TopFluor® PC; both Avanti Polar Lipids)混合，得到1 mol% 的TopFluor PC。
氯仿蒸发,脂质膜干燥过夜，加入PBS缓冲(pH值7.4)，得到总脂质浓度10mM。10 mM脂质(POPC / TopFluor PC 1 mol%)穿过孔隙大小100 nm的聚碳酸酯膜30次，得到荧光标记大单层囊泡(LUVs)。
通过动态光散射分析得到的荧光标记LUVs，其z-平均流体动力学直径为118±7 nm，多分散性指数为0.2±0.08。
2.制备SMALP纳米盘
PBS (pH7.4)稀释苯乙烯-马来酸(SMA 3:1)共聚物原液。为分析纳米盘的形成，将LUVs与SMA以不同比例混合，在21℃温度下孵育至少2小时。Fluidity One-W检测样品。
结果
在微流控芯片上，当样品通过芯片时，记录未扩散样品(Fundiffused)和扩散样品(Fdiffused)的荧光强度。
没有加入SMA时，完整LUVs的荧光信号比(SR)，SR=Fdiffused/Fundiffused，为~0.15，为低扩散水平。
相比之下，在SMA存在的情况下，荧光SR值为0.75，表明大的LUV转化为小得多的微小纳米盘，引起了更高水平的扩散。
为了分析SMA与脂质的比例如何影响SMALP纳米盘的大小，不同浓度(25 µM, 50 µM 和100 µM)的荧光标记LUVs与SMA混合。
当SMA/脂质≥0.08时，SR的增加表明SMA从LUVs中提取脂质，形成小颗粒物，与完整的LUVs共存。
SMA /脂质= 0.15时， LUV完全溶液化2。根据Fluidity one-W检测结果，SMA /脂质= 0.15时， SMALP纳米盘平均Rh是20 nm；随着SMA比例的提高，最小Rh为4.5 nm 。
根据测量的Rh值，确定了纳米盘的半径(Rdisc) 3。假设POPC-双分子层厚度为4 nm4，那么Rh值为20 nm和4.5 nm时，Rdisc值分别为26 nm和5 nm。
这种Rdisc的变化可直接转化为嵌入的脂质的数量。
结论
Fluidity one-W利用MDS技术，直接在溶液中检测分子结合事件，是一种通过微量样品检测SMALP纳米盘形成的理想工具。SMALP纳米盘的平均流体动力学半径根据SMA/脂质比例不同从20 nm到4.5 nm不等。这种大小的变化将显著改变任何嵌入蛋白周围的脂质环境，因此在纳米盘研究中至关重要。
采用微流控扩散（MDS）技术的Fluidity one-W是一款非常实用的分子互作仪。研究人员可以在溶液中以及在复杂的生物学背景（例如粗裂解液或血浆中）研究蛋白质相互作用。还可以分析难以研究的蛋白质(例如膜蛋白质，多蛋白质复合物和固有紊乱的蛋白质)的相互作用，其中许多蛋白质都是重要的药物靶标。此外，由于它报告了结合和未结合物质的绝对大小，因此可以与结合亲和力同时评估化学计量和结合性质，从而全面了解结合事件。
//亲和力检测
//蛋白稳定性检测
//化学计量参数检测
//直接检测血清中抗体浓度和亲和力
//膜蛋白分子互作最佳检测方法
//在溶液中直接检测，更接近天然状态
//非表面结合原理，无需担心非特异性结合
//兼容细胞裂解液、培养基、血清等复杂的溶液背景
参考文献
1、Dörr, J.M.; Scheidelaar, S.; Koorengevel, M.C.; Dominguez, J.J.; Schäfer, M.; van Walree, C.A.; Killian, J.A. The Styrene-Maleic Acid Copolymer: A Versatile Tool in Membrane Research. Eur Biophys J Biophy. 2016, 45, 3-21. (publication)
2、Vargas, C.; Cuevas Arenas, R.; Frotscher, E.; Keller, S. anoparticle self-assembly in mixtures of phospholipids with styrene/maleic acid copolymers or fluorinated surfactants. Nanoscale. 2015, 7, 20685-20696. (publication)
3、Glover, K.J.; Whiles, J.A.; Wu, G.; Yu, N.; Deems, R.; Struppe, J.O.; Stark, R.E.; Komives, E.A.; Vold, R.R. Structural evaluation of phospholipid bicelles for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 2001, 81, 2163-2171. (publication)
4、Kučerka, N.; Nieh, M.P.; Katsaras, J. Fluid phase lipid areas and bilayer thicknesses of commonly used phosphatidylcholines as a function of temperature. BBA-Biomembr. 2011, 1808, 2761-2771. (publication)
