细菌的革兰氏染色和特殊形态观察
革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。1884 年 由丹麦医师 Gram 创立。近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰染色的机制提出不同的看法。一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也因物理结构不同结果不同，例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染剂（增加染料和
细胞的亲和力）后，用脱色剂（酒精或丙酮）脱色，再用复染剂染色。如果细菌
不被脱色而保存原染液颜色者为革兰阳性菌(G＋)；如被脱色，而染上复染液的颜
色者为革兰阴性菌(G-)。此染色法可将所有具有细胞壁的细菌分为两大类：革兰 阳性菌和革兰阴性菌。
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。
染色原理： 现在认为细菌对革兰染色的不同反应主要是革兰阳性菌和阴性菌 的细胞壁结构与化学组成不同。革兰阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量多，且交
联度大，脂类含量少，经 95％乙醇脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，
与细胞结合的结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细胞仍保留初染时的颜色。 而革兰阴性菌的细胞壁较薄，含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少，乙醇脱
色时溶解外层类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易 于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染的颜色。
实验试剂
革兰氏染色液一套
结晶紫
碘液
95%乙醇
番红花红
孔雀绿
实验设备
显微镜
盖玻片
载玻片
实验步骤
1. 革兰氏染色
（1）涂片
（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
（3）媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。
（5）复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。
（6）镜检：观察染色结果并绘图。
2. 染色过程：涂片（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（结晶 染色过程： 紫染色 1min）→媒染（碘 1min）→水洗→95%乙醇脱色（1min）→复染（番红花 红染色 1min）→干燥→镜检（油镜）
3. 油镜的使用与保养
（1）在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转 换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而 又不以压破载玻片为宜。
（2）用双眼观察目镜，并慢慢转动粗调节器至出现模糊物象，然后用细 调节器至物象清晰为止。
（3）如果不出现物象或者目标不理想要重找。
（4）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许乙醇将镜头上和标本上的香柏油 擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。
影响因素
操作因素
1、涂片太厚 在涂片时细菌挑的太多，没法分开，在脱色时就不能将第一步染上的结晶紫的颜色脱去，可能会使革兰阴性菌也出现紫色，误认为革兰阳性菌。
2、脱色时间
阳性菌透性小，不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色；但这是在固定的时间条件下的结果，如果延长脱色时间，也会使脱色剂渗透进阳性菌的细胞壁中，使染上的结晶紫脱去颜色，最后染上复红的颜色，变成革兰阴性菌。而脱色时间太短的话又会使阴性菌染上的结晶紫不能完全脱色，出现紫色，误认为革兰阳性菌。
3、固定方法
固定不仅能杀死细菌，改变细菌对染料的通透性，还能使细菌吸附在玻片上，保持原有的形态结构。固定方法是将干燥后的细菌涂片以中等速度通过火焰三次，以玻片触及手背皮肤热而不烫为宜。但在实际操作中有的同学将玻片在火焰上烤的太久，改变了细菌原有的通透性，会使细菌的染色性发生变化。影响了染色的结果。
细菌因素
1、细菌培养时间 细菌的典型形态、染色性是在对数生长期，取这时的细菌做革兰染色可以反应细菌的真实的染色性。如果细菌培养时间太长，变成了老龄菌，染色性就会发生变化，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
2、培养基的成分
一般认为革兰阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色。但是如果培养基中缺乏核蛋白质镁盐就不能合成菌体成分的核蛋白质镁盐，细菌与碘和结晶紫的复合物结合就不牢固，容易脱色，可能会使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
染液因素
1、碘液 碘液作为媒染剂能增加染料与被染物的亲和力。如果碘液放置时间太长，或经日光照射失效，失去媒染剂的作用，就可能使结晶紫与细菌结合的不牢固，容易被脱色，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
2、结晶紫 结晶紫的浓度太高，就会使染上的颜色不容易被酒精脱色，可能会使革兰阴性菌染成革兰阳性菌。
3、酒精 酒精作为脱色剂，革兰染色的脱色酒精浓度为95%
，在此浓度下革兰阳性菌染上的结晶紫不易被脱去，保留紫色，革兰阴性菌染上的结晶紫容易被脱去，最后呈红色。但当酒精的浓度为70%
时，它的脱色能力最强，可能使革兰阳性菌染上的结晶紫也被脱去，使革兰阳性菌染成革兰阴性菌。
