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张锋发表Science杂志CRISPR新综述

2016.8.09

　　新一期（8月5日）的《科学》（Science）杂志发表了一篇题为“Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems”的综述文章。瓦赫宁根大学微生物学家John van der Oos是这篇文章的通讯作者，Broad研究所的张锋（Feng Zhang）博士是本文共同作者。

　　长期以来人们认为适应性免疫是动物的一种独有特征。然而，发现在几乎一半的原核基因组中存在CRISPR-Cas防御系统则显示出了另一个方面。由于寄生物与宿主间永无止境的军备竞赛，通过平行转移完整的基因位点或单个模块，导致极大的结构和功能多样性，CRISPR-Cas 一直在快速地进化着。 CRISPR-Cas系统可分为两个不同的种类，每种包含三大类型和多个亚型。在这篇综述文章中，作者们探讨了近期取得的CRISPR-Cas研究进展，揭示出了一些精妙的分子机制，提供了一个有关CRISPR-Cas进化的可信的情景。他们还简略地描述了最近开发的广泛的基于CRISPR的应用。

　　背景

　　原核生物进化出了多个系统对抗诸如病毒和质粒等入侵物。举例来说，这样的防御系统包括受体遮蔽、限制-修饰(R-M)系统、DNA干扰 (Argonaute)、噬菌体排除(BREX或PGL)以及顿挫感染等，所有这些系统都以一种天然的、非特异的方式发挥作用。此外，原核生物还进化出了适应性、可遗传的免疫系统：CRISPR和CRISPR-Cas。将来自入侵元件的DNA序列整合到CRISPR阵列（array）中（适应阶段），再将 CRISPR阵列翻译为长pre-crRNAs并加工为短crRNAs（表达阶段），引导Cas蛋白特异性降解后来接触的同源DNA（干扰阶段），赋予了这一适应性免疫。

　　进展

　　在大多数古细菌和近一半的细菌基因组中存在着许多不同的CRISPR-Cas系统。最新的CRISPR-Cas分类表描述了两个种类，它们各自被细分为三大类型。结合生物化学与分子遗传学大大推动了揭示不同CRISPR-Cas类型许多独特的特征。此外，结构分析和单分子研究进一步增进了我们对 CRISPR-Cas功能分子基础的认识。

　　近期取得的一些进展包括揭示出了适应阶段，即加工外源DNA片段，并将其作为新的间隔序列（spacer）整合到CRISPR阵列中去时相关的一些步骤。此外，鉴别出了三种新的CRISPR-Cas类型(IV, V和VI)，尤其是V型干扰复合物已通过实验确定了特征。此外，能够借助CRISPR-Cas元件，如Cas9和Cpf1很容易地切割及编程序列特异性靶 DNA，使得研究人员可将这些CRISPR-Cas元件作为高度有效的工具，用于广泛的真核和原核生物中实现遗传工程和基因调控。利用结构引导的工程学，研究人员正在积极解决Cas9核酸酶造成脱靶切割这一迫切的问题。

　　展望

　　在文章中，作者们指出尽管在过去的几年里大大增进了对CRISPR-Cas系统的认识，还有许多问题有待揭示。不断地发现CRISPR-Cas变体可直接测试近来提出的有关CRISPR-Cas系统进化的模块化学说。近期发现并确定了一些新CRISPR-Cas类型的特征表明，以我们当前的知识来预测亲缘关系遥远的CRISPR-Cas变体的功能细节能力还相对有限。因此，需要彻底地剖析新发现的CRISPR-Cas系统认识它们的生物学作用，揭示它们的分子机制，利用它们的潜能来开发生物技术。

　　有关CRISPR-Cas生物学的一些关键的、悬而未决的问题包括，微生物适应性免疫的生态作用，CRISPR-Cas的高平行转移率，CRISPR-Cas和噬菌体编码anti-CRISPR蛋白的共进化。当前对于CRISPR-Cas的表达调控，CRISPR-Cas在防御之外的一些过程中所起的作用还知之甚少。关于CRISPR-Cas机制，阐明在间隔序列获取中适应阶段和干扰阶段之间联系的一些细节还不清楚。

　　当前了解甚少的一个CRISPR-Cas关键方面是自我/非自我识别。在CRISPR变体之间这一识别机制似乎有着很大的差异。近期比较2型效应器复合物(Cas9/Cpf1)揭示出了一些整体的结构相似性以及结构与机制差异。

　　这些CRISPR-Cas变体或许可以转化为互补的生物技术应用。结合一些用于基础研究的创新工具，CRISPR相关效应器复合物将帮助开发出新一代的抗病毒预防药物和疗法。对于人类基因治疗应用，作者们指出，仍然需要不断地改进安全、有效地将Cas9/Cpf1和gRNAs传递到细胞和组织中去的方法。进一步认识有关CRISPR-Cas结构、功能和生物学的基本细节，尤其是确定新Cas效应器蛋白的特征，对于优化及进一步扩展CRISPR-Cas系统各种应用至关重要。

张锋微生物学家

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