用显微镜多年，你调过柯勒照明吗？
在任何特定光学显微镜设置中，柯勒照明技术都是实现最佳成像的最重要、最基本的技术之一。正确调节柯勒照明后，可以确保均匀的反差和照明、较高的分辨率以及更多细节，从而大幅改善图像的质量。
尽管这项技术属于设置显微镜的常规内容，但这项技术目前仍未在显微镜工作者中获得广泛实施。实际上，了解两个主要显微镜部件(视场光阑和聚光镜)后，完成正确设置就只是几分钟的事情了。
本文介绍了柯勒照明的主要原理，以及如何通过五个简单步骤来进行调整。
August Koehler(1866-1948)
August Koehler于 1893 年发表了他发明的照明方法后，这项“柯勒照明”技术就以其名字予以命名了。柯勒的照明方法发表时，大多数显微镜都借助镜子和煤气灯作为照明光源。再加上显微照相术，研究人员一度使用需要长时间曝光的乳胶板，这通常会导致成像的不一致性。
重要原理
即使今天，柯勒的均匀照明技术仍然被广泛使用，并构成了共聚焦、相差以及微分干涉相差 (DIC) 显微术等众多技术的基础。一旦您了解如何使用正确的柯勒照明来设置显微镜后，完成设置仅需不到一分钟的时间，却为成像效果带来极大改善：这样能够确保光源均匀照射样本，使图像更清晰，并提高染色区域之间以及切片组织区域之间的反差。
如果您要在 PPT 演示、海报展示中使用图像，或要将图像提交给某家杂志，那么，柯勒照明是必须的。这个简单的“五步走”技术将对您大有裨益。
在您实现柯勒照明过程中，除了显微镜物镜之外，还需要注意并调节另外两个部件。
视场光阑
“视场光阑”作为显微镜主体的一部分，通常位于底座(正置显微镜)之中，参见图 1。视场光阑仅用于控制最终到达载物台上载玻片的光量。控制光源发出的光量，即可减少由光源引发的眩光，从而确保图像拥有更好的反差。
图 1：正置显微镜的主要部件。视场光阑用于控制来自光源的光强。聚光镜用于将光源发出的光聚焦在样本上。孔径光阑用于控制照明光锥。
聚光镜
聚光镜位于正置显微镜载物台的正下方。在倒置显微镜中，则位于载物台之上、光源和视场光阑的前面，如图 1 所示。尽管聚光镜配备调焦旋钮，与显微镜的细调焦/粗调焦相似，但这个部件主要用于聚焦光源/视场光阑发出的光线，并不会对样本进行聚焦。
“聚光镜”用于收集光源的大部分光线，并将其作为成像光射线的光锥聚焦于显微镜载物台的载玻片之上。准确调整该聚光镜后，即可优化对样本的照明效果和进入物镜的光线。这样就确保了最终图像的均匀光强和反差。由于每个显微镜的物镜都不同，这就意味着更改放大倍率时，应对聚光镜予以调节。
聚光镜中含两个主要部件，您可以在设置正确柯勒照明的过程中，对这两个部件进行调节。这两个部件为：调中螺丝和光阑。与视场光阑一样，聚光镜也有一个控制光量的光阑。该光阑用于控制对样本进行照明的光锥角度。整个显微镜系统的数值孔径不仅仅是由物镜决定的。当聚光镜光阑打开时，整个仪器的数值孔径会提高，使得分辨率和反差更佳且能够实现最优照明效果。调中螺丝能够确保用于照明载玻片的光线直接射入视场角的中心，因而保证了样本周围的均匀光强。
柯勒照明的五个步骤
第 1 步：
开始成像之前，请务必检查透镜、目镜和物镜是否干净。将载玻片放在载物台上，打开灯，并将其调至最低设定值。
第 2 步：
对样本进行聚焦。首先，关小位于正置显微镜底座或倒置显微镜聚光镜之上的视场光阑。俯身查看目镜时，您刚好能看到载玻片上的小光圈，参见图 2。
图 2：关闭视场光阑。
第 3 步：
对聚光镜进行调焦。当您坐在显微镜前时，调节聚光镜的旋钮通常位于调焦旋钮的正前方。当您俯身查看目镜时，缓慢地上下移动聚光镜。此时，您将看到光圈的边缘处于聚焦和未聚焦状态，而且，光圈将从红色条纹变成蓝色条纹。尽可能将光圈的边缘调节至最清晰状态，参见图 3。
图 3：对聚光镜进行调焦。
第 4 步：
一旦光圈清晰后，请将目光从目镜上移开，并查看显微镜的聚光镜部件。此时，您将看到调中螺丝。握住螺丝时，再次俯身查看目镜。缓慢拧动螺丝时，您会看到光圈在视场中移动。您应该将光圈移动至样本视场中间位置，参见图 4。
图 4：对聚光镜进行调中。
对聚光镜进行调中后，打开视场光阑直至光圈边缘正好消失，参见图 5。
图 5：打开视场光阑。
第 5 步：
采用可变(或孔径)光阑完成最终调整。在调中螺丝正下方(倒置显微镜则位于上方)，您会发现与视场光阑相似的另外一个光阑。当您俯身查看目镜时，将其完全打开，然后逐渐关小该光阑，直至图像眩光消失。关闭光阑时，样本的反差将提高，而分辨率却会降低。
以上就是实现柯勒照明的五个步骤了。
总而言之，这五个步骤就是：关小视场光阑、对边缘进行调焦、调中光斑、开大光阑、减少眩光。
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