大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验概要
获得感受态细胞；制备含有目的片段的克隆。
实验原理
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法使用更广泛。
转化率的计算：
统计每个培养皿中的菌落数。转化后在抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
转化频率（转化子数/每ug质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量（ug）
感受态细胞总数=对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数
为了提高转化效率， 实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH-5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行， 所用器皿， 如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染， 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后筛选、鉴定带来不必要麻烦。
本实验以E.coli TOP10菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC质粒共保温，实现转化。由于pUC质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了pUC。
主要试剂
0.1 mol/L CaCl2 （灭菌）、无菌水、冰、LB液体培养基（胰蛋白胨、酵母粉）、氨苄青霉素（Amp）、温控摇床。
主要设备
控温摇床(37℃)、冷冻离心机、水浴锅、冰箱（-20℃，‐70℃）、超净工作台 、 培养箱(37℃)、分光光度计、液器、枪头、离心管、三角瓶、150px平皿、酒精灯 、 三角玻棒、酒精棉球、火柴
实验材料
E.coli.（TOP10）、重组质粒
实验步骤
第一天：
从大肠杆菌TOP10平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
第二天：
1. 取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养。2－3 h(此时，OD600 ≤ 0.4-0.5，细胞数务必 ≤108／mL。（此为实验成功的关键)
2. 将菌液转移到1.5 mL离心管中，冰上放置10 min。
3. 离心10 min（4000r/min），回收细胞。4℃
4. 倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。
5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 0.5 mL悬浮沉淀，立即放在冰上30 min。
6. 4℃ 6000 r/min，离心10 min，回收细胞。
7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 0.1 mL悬浮细胞，（务必放在冰上）。
8. 分装细胞，每1200 μL一份。此细胞为感受态细胞。
转化：
1. 取100 μL新鲜制备的感受态细胞，加入DNA（重组质粒）10 μL（50 ng ）混匀冰上放置30 min。
2. 将管放到42℃循环水浴90sec。
3. 冰浴2 min。
4. 每管加600 μL LB液体培养基，37℃培养1 h（慢摇）。
5. 将适当体积（200 μL）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。（20uLx–gal,4uLIPTG）
6. 倒置平皿37℃培养12－16 h，出现菌落。
7. 计算转化效率
注意事项
1. 无菌操作。
2. 低温操作。
3. 注意加AMP时的温度，温度不能过高（55-60度），否则加入的抗生素失活，会使克隆株无法筛选出来。
