蛋白质与多肽激素的放射免疫分析-3（1）

　（四）磁性分离法

　　1975年，Hersh报道了用磁化分离技术分离血清狄高辛放免测定的B、F后，受到了广泛的重视。近年来国内外许多学者对磁化颗粒的制备进行了系统地研究，应用于B与F的分离，并取得了引人注目的进展，使放免的B、F分离不再使用离心，缩短了放免操作时间，便于放免自动化测量。磁性分离的具体原理为血清样品与标准品中的抗原与磁颗粒上的一定量的抗体反应，产生的抗原抗体磁性颗粒复合物，在磁场作用下沉降，使结合部分与游离部分分离。在磁性分离器上弃上清，进行测量。优点是简化了操作程序，B、F分离也较完全，稳定性好。

　　目前常用的磁性分离技术除磁性固相抗体外，还有磁化活性炭吸附分离剂。

　　（五）固相包被分离法

　　近年来由于固相技术的研究使其固相所被（埋）技术发展迅速，再有固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等优点，有逐渐取代液相法的趋势。

　　1990年，Causse报告了活化塑料管新技术及生物素结合抗体、亲和素标记物的应用，使放免技术对多数微量物质的检测可达到10^-15g级水平，大大提高了放免测定的精确度、灵敏度。

　　抗体包被：物理吸附法—方法简便，但包被量低。

　　价键结合法—需要纤维素、琼脂等固相载体，操作复杂。

　　Causse活化塑料管新技术，提高了包被量，主要特点是将顺丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚体涂布试管，在试管壁形成一层活性薄膜（这种方法操作简便）。

　　（六）双抗体+PEG的分离法

　　这种分离方法利用双抗体特异性强、PEG沉淀简便快速的优点，从而克服了双抗体时间长、PEG方法非特异结合高的缺点。这一方面是当前分离技术中较理想的一种方法。

　　这种联合方法分离方法减少了第二抗体的用量，PEG的最终浓度也只需2～4%，成本较低。这种方法既适用于蛋白质、酶、大分子物质，又适用于小分子肽等半抗原物质。

　　1991年，北京中国同位素公司北方免疫试剂所采用80年代法国广泛应用的双抗体+PEG、再加一定剂量的γ球蛋白（免疫第二抗体时应用的γ球蛋白）的分离剂，溶解于磷酸缓冲液中，pH在7.4左右。这种分离剂推广应用产生了很好的效果。沉淀完全，牢固，而非特异性结合低，时间短（加入分离剂15min后即可离心），受温度影响小，受到用户的广泛好评。

　　以上方法，要依据反应液中反应物分子量大小，酸碱度等特点，选择合适的分离方法及分离剂。

第四节　样品的前处理

　　样品的正确收集与处理，是蛋白质及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的样品与测定项目，其前处理有不同的要求。下面以神经肽测定为例，介绍样品的前处理方法。

　　一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取（以大鼠为例）

　　1．大鼠称重后，在尽量安静的情况下，迅速断头、取躯干血。

　　2．尽快取下全脑、脊髓（某段）与垂体，在沸生理盐水中煮5min，以灭活酶，保持神经肽的稳定。

　　3．根据实验要求分出脑区（如小脑、桥延脑、下丘脑、中脑或中央灰质、丘脑、皮层、海马、纹状体等与垂体前叶。

　　4．脑区等称重。

　　5．把脑区、垂体或脊髓，分别置于玻璃匀浆管内，加入1mol/l HAC（或HCl）1ml，充分匀浆后倒入塑料指形管中，在室温下放置100min，使生物活性物质充分溶解在酸中。

　　6．加入1mol/l NaOH 1 ml，中和酸。

　　7．离心，取上清。

　　8．低温（-20^℃以下）保存待测。

　　二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法（以下丘脑为例）

　　1．大鼠迅速断头，取出全脑，置沸生理盐水中煮5min。

　　2．将全脑置于取材角度器上，分别于视交叉前和乳头体后用双面刀片垂直切断，取下丘脑块。

　　3．将双面刀片装在切片机上。

　　4．将下丘脑置于切片机机载物台上，腹侧向下，并用502胶水固定。在脑块后方适当放置琼脂块以利固定。

　　5．开动振动切片机，缓慢移动推进器，切片厚400～500μm。用毛笔沾生理盐水，小心收集切片置于平皿内的生理盐水中。

　　6．将脑切片平置于橡皮板上，并在体视显微镜下，参照鼠脑立体定位图谱，确定神经核团位置。

　　7．选择相应直径的穿孔器，分别于两侧核团上垂直插下，然后推出针蕊将所取核团组织放入匀浆器中。

　　8．加入1mol/l HAC 0.5ml, 充分匀浆后倒入放免测定管中，放置100min。

　　9．加入1mol/l NaOH 0.5ml中和酸，离心（3000rpm/min）20min，取上清液，低温保存待测。

　　三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取（以胃粘膜为例）

　　（1）取下胃粘膜后，迅速称重置于试管，中沸蒸馏水1ml，在水浴中煮100min。标本在室温下放置，其中的生物活性物质会被酶降解，所以要立即加热处理。

　　（2）冷却后倒入特殊的匀浆器中，充分匀浆（使用电动搅拌器）。匀浆液倒入塑料指形管中，再用蒸馏水1ml，冲洗匀浆器，并倒入上述管中。

　　（3）离心，取上清，低温保存待测。

　　四、血浆

　　1．直接测定

　　（1）加酶抑制剂：准确采全血若干毫升，注入预冷的加有①抗凝剂0.3mol/l EDTA·2Na（乙二胺四乙酸二钠）溶液（每毫升全血20μl）、或1%肝素（每毫升全血10μl）；②抑肽酶（每毫升全血500单位）的塑料指形管中，迅速低温离心，取血浆低温保存待测。

　　抑肽酶有液体的（标签写的有每毫升含多少单位）与固体的（每毫升含12TIU，1TIU=900KIU，即每毫克含10800单位）。固体的抑肽酶可用生理盐水溶解，使之每20μl含500单位。

　　（2）酸化处理：每毫升血浆加1mol/l HCl 0.2ml，低温保存待测。测定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

　　以上两种方法，任选一种即可。

　　2．间接测定血标本经提取后，可去除蛋白质等干扰因素，并使微量的生物活性肽浓缩，但较费时，成本也高。常用的提取方法有：

　　（1）柱层析提取法：有多种层析柱可供提取不同的神经肽，其中较为方便的是用Sep-pak C₁₈层析柱提取。主要步骤步：

　　①柱的预处理：该柱有两头，长头连接注射器，可注入溶液与样品，短头为排出口。预处理时注入乙腈10ml。蒸馏水20ml，使柱中的生物胶活化。

　　②注入样品（如血浆、脑脊液、腹水、尿等）：样品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用时间。]

　　③淋洗：用4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些杂质。

　　④洗脱：用7ml酸性乙腈（按容积算，每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸馏水21ml）作为洗脱剂，注入柱中，把生物活性肽洗脱下来，收集在塑料指形管中。

　　⑤清洗：用乙腈、蒸馏水清洗柱子，以备后用。

　　⑥将洗脱液吹干，低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。

　　Sep-Pak C₁₈柱层析，也可用于制备标记抗原时的层析纯化。

　　（2）加膜藻土提取法：

　　①抽血：用一次性塑料注射器抽取受试者静脉血4ml，置于加有肝素（125单位/ml 全血）指形管中。

　　②分离血浆：在4^℃下离心，取出血浆。

　　③血浆酸化：取2ml血浆，加入1mol/l HCl 0.5ml, 摇匀。

　　④吸附：加入0.5%藻土悬液2ml，在水平震荡器上震30min。离心，去上清，留沉淀。

　　0．5%藻土县液（Fuller’s earth)的配制：

　　0.5g Fuller’s earth

　　0.1g Dextran T₇₀

　　100ml去离子水

　　⑤洗脱：在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml，在漩涡振荡器上振2min，离心，取上清置于经硅化的玻管中。

　　80%酸性丙酮的配制：

　　80ml丙酮

　　20ml 1mol/L HCl

　　⑥去脂：加入石油醚1ml，摇匀，脂肪溶解在石油醚中，分层后吸去上层。

　　⑦干燥：下层液体，置于37℃水浴中，用氮气（或空气）吹干。

　　⑧低温保存待测。测定时用一定量缓冲液溶解。

　　（3）有机溶剂提取法：常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。将溶剂按一定比例，加入标本内，混匀、振荡、离心，取上清吹干，冷藏待测。通常在有机溶剂中加入适量的酸。

　　在这些方法中，以柱层析法最稳定、准确，但成本高，推广不易。加膜藻土法，提取率较高，但操作复杂、费时。有机溶剂提取法操作方便，成本也低，虽稳定性较差。

　　五、脑脊液

　　1．煮沸收集脑脊液时，管子浸在冰水中。收集完毕，立即在沸的水浴中煮5min。离心、取上清；低温保存，待测。

　　2．酸化在1ml脑脊液中加入1mol/l HCl 0.2ml；测定时，再加入1mol/l NaOH 0.2ml中和。

　　3．加酶抑制剂

　　4．柱层析提取

　　以上方法，任选一种。

　　六、尿

　　尿液收集于事先加有适量醋酸或盐酸的容器中，使pH达4左右，煮沸1～2min，冷却后离心，取上清，加适量NaOH液，使尿液pH达7.0左右。此尿即可用于直接测定或经提取后再测定。

　　尿认提取法相同。采用Sep—Pak C₁₈柱层析提取较为方便，因尿中不含蛋白，柱子可多次使用。

　　七、胃液

　　抽取胃液，注入加有抑肽酶的管中，离心，取上清，低温保存待测。

第五节　放射免疫分析法的建立

　　一、放射免疫分析的基本试剂

　　（一）标准品

　　标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。

　　按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。

　　（二）标记物

　　标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。

　　要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量，在使用¹²⁵I时达5000～15000cpm。

　　（三）抗体

　　应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。

　　根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。

　　（四）B与F分离剂

　　以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制：

　　活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型）

　　右旋糖酐T₂₀0.2g

　　加0.1mol/L PB 至100ml

　　电磁搅拌1h，然后置于变通冰箱冰箱待用。

　　（五）缓冲液

　　放射免疫分析技术所用的缓冲液有多种，要通过实验选用抗体和抗原结合最高的缓冲液。

　　目前最常用的缓冲液有下列几种：①磷酸盐缓冲液；②醋酸盐缓冲液；③巴比妥缓冲液；④Tris –HCl缓冲液；⑤硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。

　　在缓冲液中，除必须有弱酸及弱酸的盐成分外，还应根据不同检测项目加入下列物质：①保护蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明胶，浓度为0.1%～0.2%，用以降低试管对抗原的非特异性吸附。②防腐剂：多采用0.1%叠氮钠、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制剂：如测定心钠素等肽类激素时，要加入适量的抑肽酶，用以抑制血浆内源性水解酶对待测物的降解；又如测定cAMP、cGMP时，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻断剂：在测定甲状腺激素或测定某些甾体激素时，必须加阻断剂，使和蛋白质相结合的激素，变为游离型。常用的阻断剂有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水杨酸钠、三氯醋酸钠等。⑤载体蛋白：采用二抗作B与F分离剂时，要向反应液中加入适量与第一抗体同种动物的正常血清。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用PEG沉淀剂分离B、F，必须加适量γ球蛋白或正常人混合血清。

　　在神经肽的RIA时，常用PELH缓冲液，（按1000ml,pH7.6）：

　　0．1mol/l PB　　　　　　　　980.0ml

　　0.3mol/L EDTA·2Na　　　　　10.0ml

　　0.2%洗必泰溶液　　　　　　　10.0ml

　　溶菌酶　　　　　　　　　　　1.0g

　　二、加样程序

　　由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：

　　（一）平衡饱和加样程序

　　1．基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到再不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

　　2．加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。

　　在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。因此，上述加样程序就更有必要，所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清，后加标记物。这样测定也比较稳定。

　　在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中，如果是双抗体分离法，抗原和标记抗原与抗体三者加样，可不分先后，有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序，但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24～48h，再加双抗体，继续温育24h，使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析，应用双抗体分离法，其流程比较长，这样的顺序同样可不分先后。

　　以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例：

　　（1）加样（单位μl；总反应体积500μl）

　　（2）孵育：4℃，24h

　　（3）分离B与F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的CPM数。

　　（二）顺序饱和加样程序

　　1．基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应12～24h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。

　　应用顺序饱和加样，可以提高测定方法的灵敏度。Utiger在做人促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析时，将标记物延至第2天加入，发现其灵敏度增加两倍。如果缩短最后的温育时间，仍可取得满意的结果。所以一般认为，在顺序饱和加样中，第1次温育时间可以长，而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。但也有相反的意见，认为顺序饱和加样，是使用过量抗体，会使灵敏度受到一定影响。如果使用抗体不过量，温育时间缩短，在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物，这样既不影响加灵敏度，反而比较稳定，甚至可提高灵敏度。

　　2．加样程序　以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例（直接测定）。

　　（1）加样（单位μl；总反应体积600μl）

　　（2）孵育：4^℃，24h。