不同的方法需要不同的策略

图1.  保留因子、拖尾因子、分离度及理论板数的计算。

几乎每一个色谱工作者都做过液相方法开发的工作。不管你的工作是要对一个常规的方法进行偶尔的调整，进而建立一个一次性的方法来支持化学合成，还是需要采用一个成熟的方法来进行生产过程的检测，对液相方法开发原则的深刻理解都是很有价值的。

根据经验，“完美”的液相方法是不存在的，每一个方法都可以做得更好。“没有最好，只有更好”只是方法开发的首要原则，要想让方法做得更好一点，随之花费的时间可能是分析人员所无法承受的，所以，开发一个适合于手边工作的方法即可。

目标是什么？

很多色谱工作者在进行方法开发项目开始，心中没有一个即使是模糊的目标，感觉工作最终是靠反复试验完成的，而不断试验常常会以反复失败结束，这样浪费了宝贵的时间和金钱。但大部分人都没有大量多余的时间，可以花费在探究导致偏离目标的可能性上，所以都需要一个目标，这个目标根据不同情况也有差异。如果想快速检测合成产物的纯度，那么通常30min梯度洗脱的方法就可以做这项工作，不需要投入再多。相反，如果你的方法是要对10000个临床研究样品进行技术支持的话，那么将运行时间从6min减少到4min会是你值得去做的事情。下面所列的是用在液相方法开发中的一些因素，希望可以帮助你确定目标：样品数量；运行时间；被分析物数量；基质的数量；灵敏度；重复性；精密度和准确度；浓度范围；定性和定量；仪器及操作限制；样品制备要求；验证要求。

当然，影响液相方法开发的因素有很多，没有必要去详细讨论每一个因素，这里举几个例子。在溶出度试验中，有两个需要定量的活性成分，它们的浓度为mg/ml，如果通过观察稳定性指示的检测或杂质分布图进行，其中破坏性降解的样品能产生5~30个峰，其中一些峰面积可以是主成分色谱峰面积的0.05%~0.1%。在后一种情况中，分离会比前者更具挑战性，所以你可以以一个有更强分辨率的试验性方案开始。但将能想到的很多方法特征列出来确是一个不错的想法。如果一个新的方法是对以前方法的修饰或与其它方法相似，你可以采用现有方法中的性能指标作为方法开发的起点。

方法完成的确定

你需要有一种方式来量度方法开发的终点，以便不会落入“只是多一次实验”的陷阱，使方法开发的过程没有必要的延长。你需要一些定量指标来量化所开发的可以应用的方法，方式之一是遵循管理机构的建议。例如，美国食品药品管理局药物评价与研究中心（FDA-CDER）出版的“指导原则”可有计划地去帮助他们的职员依据法规审查色谱方法的性能。其中之一就是色谱方法的验证的指导原则 。这不是一个法律或政策，但它给予了我们一个好的概念，即检查员将查看方法的哪些方面。四个定量的标准即为保留因子k（在文件中为容量因子k'），拖尾因子Tf （文件中为T），分离度Rs，理论板数N，这些都是非常好的评价任何分离效果的指标，同时也是建立用于在运行批样品测试方法之前的系统适用性试验的核心指标。

K=（tR-t0）/t0 ［1］

保留因子是衡量样品在固定相和流动相之间分配的指标，但是从实际经验来看是用其它方式来衡量保留行为。

其中tR及t0相应为保留时间及死时间。如图1所示，死时间常常以不保留化合物进样或以基线的最先波动来判定，通常认为是溶剂峰。保留时间是指进样直峰最大的时间，理论上说，对于最好的色谱性能，所有色谱峰能在2<k<10时被洗脱出来，但1<k<20也是可接受的范围，尤其是对于复杂的样品。在k<2时，对于大多数色谱图，色谱峰将会在无保留t0时被冲洗出来，并且保留时间会因流动相组份的微小变化的改变比k>2时更敏感。FDA推荐k>2，在图1中，t0=1.00 min，tR1=3.00min，tR2= 3.40min，所以 k1=（3.00-1.00）/1.00 =2.00，k2=2.4。

拖尾因子有时以对称性因子来表示，衡量色谱峰的前沿或拖尾。

Tf=（a+b）/2a [2]

其中a 和 b如图1所示，从色谱峰的顶点划一条垂直于5%峰高处的直线，其交点到峰前后的距离分别为a 和 b。FDA推荐Tf<2，但如果Tf ≤1.5，则色谱峰型更为好看，条件更好小峰更易与主峰分离。对于图1中，色谱峰2，a=0.10 min，b=0.16 min，故Tf=（0.10+0.16）/（2×0.10） =1.30。

分离度表示了两个色谱峰在色谱图中的分离情况，其中t1和t2相应为色谱峰1和色谱峰2的保留时间，w1和w2为色谱峰1及2的峰宽，可由测量峰拐点处的切线与基线交点间的距离得到。测量基线峰宽不太方便，特别是如果噪音或基线漂移或者色谱峰不能完全分离的时候。多数人喜欢以测量半峰高处的峰宽即w0.5来代替峰宽，如图1 所示，因为更方便且不易出错。那么，公式3 变为公式4。

Rs=（t2-t1）/0.5（w1+w2） [3]

Rs=（t2-t1）/1.7×0.5（w0.5,1+w0.5,2） [4]

对于峰型很好的色谱峰来说，达到基线分离Rs=1.5，但当出现峰拖尾等情况时，这也不能保证两峰完全分离，FDA推荐Rs> 2。如图1所示，w0.5,1=0.112min，w0.5,2=0.126min，所以 Rs=（3.40-3.00）/1.7 × 0.5（0.112 + 0.126） = 1.98。

理论板数（也称柱效）是衡量柱效的指标，理论板数主要受填料的粒度（粒度越小N值越大）及柱长（色谱柱越长，N值越大），以及流速、温度、流动相组成、样品分子量等影响。理论板数按下式计算：

N=16（tR/w）2 [5]

如测量分离度中的峰宽一样，半峰高处的峰宽比较容易测量，所以大多数色谱工作者喜欢用下式计算。

N=5.54（tR/w0.5）2 ［6］

一个新的150mm ，填料粒径为5μm或100mm，填料粒径为3μm的色谱柱，如用一个适合的化合物来测试的话，其柱效会有N = 12000或者更高，但在实际样品测定时，多为N=10000。

FDA推荐N>2000，这个柱效在一个50mm，5μm不是很好性能的色谱柱上即可得到。所以，我认为这个指标不太值得用于评估色谱柱的好坏。对于图1中，色谱峰1，N=5.54（3.00/0.112）2=3975，有一点要记住，公式5和公式6均为等度洗脱时的情形，对于梯度洗脱，则不适用。

上面已经将方法建立所需的元素罗列出来，也已经有了定性及定量的 （Rs、k、运行时间等）指标来判断方法是否满意。