microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术（三）

评估RNA分离的需要，我们直接在miRNA的检测中增加了细胞裂解物。相当于直接在7.5毫升逆转录反应中添加2.5-2500细胞。当检测到，在一些细胞中CT值相关R2>0.998）的RT反应至少有三个数量级（图4）。

图3。总RNA输入的阈值循环（CT）值检测8个miRNA的相关性。每RT反应中，小鼠肺总RNA输入范围从0.025到250纳克。将新杆状线虫的miRNA（MIR-2）列入作为阴性对照。

鼠或人的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎（10-12天）的总RNA样品均购自Ambion公司。根据标准曲线lin-4合成的miRNA对每个细胞拷贝数进行估计。每个RT反应中添加150ng的RNA（或相当于约10 000个细胞，假设每个细胞中有15pg总RNA）。依据TaqMan磷酸甘油醛脱氢酶的内对照（P / N4352339E）将RNA规范化输入。

检测了12组非特定的基因组DNA对TaqMan miRNA的影响。结果表明，RT反应中是否添加5纳克人类基因组DNA对CT值没有影响，表明RNA的目标（数据未显示）检测是非常特异的。基于这一观察，我们直接miRNA定量检测中增加了热处理细胞。图5显示了使用纯化总RNA，细胞裂解物，从同样数目的HepG2细胞得到的热处理细胞的miRNA进行定量比较。直接添加热处理细胞的miRNA的检测CT值最低，和其他三种不同的样品制备方法相似。

图4。使用OP9细胞裂解物检测TaqMan miRNA的动态范围。 每个RT体系中输入细胞数范围为3至2500个细胞。采用新杆状线虫elegans miRNA（MIR-2）作为阴性对照。