转基因产品核酸水平检测流程
转基因食品问题,一直以来都是充满争议的话题;如何科学正确地检测转基因产品,成了政府检测机构及相关工作者高度关心的问题。
转基因农产品的检测,就是检测农产品中是否含有外源基因,即检测启动子、终止子、标记基因、目的基因、外源基因转录产物的丰度等。就方法而言,又分为基因水平的检测和蛋白水平的检测。
转基因产品核酸水平检测的流程如下:
第一步:样本前处理
称取一定质量的样品,在研钵中研磨或用自动组织匀浆仪处理,得到样品粉末,同时使组织细胞破壁、释放出核酸。
第二步:DNA提取纯化
可以采用商业化DNA提取试剂盒,手动或利用自动核酸提取纯化系统制备DNA模板,用于后续的PCR分析。
第三步:内源基因的检测
对物种内源基因的PCR检测,主要用于验证DNA模板的提取质量;
可采用普通PCR方法将目标内源基因扩增后,通过琼脂糖凝胶电泳分离,利用凝胶成像设备观察分析是否有出现预期大小的扩增条带;
也可通过实时荧光定量PCR方法直接检测目标内源基因的有无。
检测结果阳性表明从样品中提取出适宜进行检测的DNA,可以进行外源基因检测,否则应重新进行DNA提取和纯化。
第四步:筛选基因检测与品系鉴定检测
对植物中转基因成分的检测,先筛选检测CaMV 35S、NOS、NPTII、PAT、BAR基因(启动子、终止子等等),确定是否含有外源基因;筛选结果阴性则直接报告结果;
若筛选结果阳性,则需要进一步鉴定检测MON810、Bt11、Bt176、T14/T25、CBH351、GA21、TC1507、MON863、NK603、Bt10(结构基因)的结构特异性基因或品系特异性基因以确定是何种转基因品系。
这两个步骤均可通过普通PCR或者实时荧光定量PCR方法完成。
第五步:确证实验
如果采用普通PCR方法检测筛选基因与结构特异性基因或品系特异性基因结果为阳性,则需要通过采用实时荧光PCR方法进行结果确证实验。
第六步:结果判断与计算
待测样品外源基因检测Ct值≥40,内源基因检测Ct值≤24,对照正常,则可判定该样品未检出XXX基因; 待测样品外源基因检测Ct值≤36,内源基因检测Ct值≤24,对照结果正常,则可判定该样品检出XXX基因; 待测样品外源基因检测Ct值在36-40之间,应重做实时荧光PCR扩增。 定量计算:利用阳性标准品与基因检测Ct值,可以分别计算出外源基因与内源基因序列拷贝数,按照下列公式对转基因成分进行定量计算: |
第七步:结果表述
定性结果表述:
对于X物种,未检出转基因成分;
对于X物种,检出转基因成分,(可进一步报告)该样品中含有XX转基因品系。
定量结果表述:
未检出转基因成分,定量方法检测限为X%;
样品中XX转基因成分低于本定量方法检测限(X%);
样品中所含XX转基因成分为X%。
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