致泻大肠埃希氏菌鉴定剂盒（pcr法）使用说明
致病微生物系列
致泻大肠埃希氏菌鉴定剂盒（PCR法）
产品说明
致泻大肠埃希氏菌鉴定剂盒参照《GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》进行设计，可针对食品样品中的致泻大肠埃希氏菌特异核酸片段进行扩增，通过电泳判断样品的鉴定结果。该产品检出限为10^3 cfu/ml（使用旋达071021M细菌基因组DNA提取试剂盒提取1 ml 10^3cfu/ml增菌液的细菌基因组DNA作为模板）。
一管式检测试剂为本公司研发的产品，与传统PCR法检测试剂具有等效的检测性能，其中的固封液不影响检测反应与荧光检测性能，并且对试剂蒸发与气溶胶污染起到一定的防范作用。该产品无需分装试剂，有效减少反复冻融及分装过程中造成的试剂活性下降及试剂污染，无需增设试剂配置区，省时省力省空间。（该产品反应液中已含荧光染料，可直接使用荧光定量PCR仪进行定性检测）
◆ 产品组成（96测试）
试剂
含量
作用
孔1
反应液-uidA
23μl/孔
12孔/排
8排
（本产品使用12联PCR管分装，每排含12种反应液各23ul）
内参
孔2
反应液-ipaH
鉴定EIEC
孔3
反应液-pic
鉴定EAEC
孔4
反应液-aggR
鉴定EAEC
孔5
反应液-astA
鉴定EAEC
孔6
反应液-stx1
鉴定EPEC与EHEC
孔7
反应液-stx2
鉴定EPEC与EHEC
孔8
反应液-bfpB
鉴定EPEC与EHEC
孔9
反应液-escVa
鉴定EPEC与EHEC
孔10
反应液-lt
鉴定ETEC
孔11
反应液-stp
鉴定ETEC
孔12
反应液-sth
鉴定ETEC
NG-Ecoli
100μL × 1支
阴性对照
NG-DW
100μL × 1支
空白对照
PG-Ecoli
100μL × 1支
阳性对照
Loading Buffer
600μL×1支
电泳上样缓冲液
◆ 所需仪器
ABI ，BioRad，TaKaRa等PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等电泳配套设备。（使用荧光定量PCR仪进行定性判读时则无需电泳设备）
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②冰盒；③移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；④离心机；⑤涡旋混匀器；⑥金属浴。
◆ 样品处理
参照《GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组DNA提取系列产品。
◆ 实验操作
1．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）
取所待检样品数+3的12联反应管，将试剂完全解冻，分离心30s。离心后揭开封口膜，使用穿刺加样法穿过固封层向每管反应液中分别加入2μL模板（或直接使用无菌吸头挑取少许待检菌落至反应管中）。
加样示例：（有2个待测样品）
取5排12联反应管，按顺序第一排全部加NG-DW，第二排全部加NG-Ecoli，第三排全部加样品1，第四排全部加样品2，第五排全部加PG-Ecoli。
盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。
2. 扩增反应（扩增及产物分析区）
按下列条件设置扩增反应：（如需使用荧光法进行检测请选择FAM通道）
PCR循环
荧光收集位点
95℃
10分钟
1个循环
—
95℃
30秒
30个循环
—
63℃
30秒
—
72℃
90秒
※
72℃
5分钟
1个循环
—
3. 产物电泳（扩增及产物分析区）
称量4. 0g琼脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至60℃左右时，加入溴化乙锭( EB )至终浓度为0.5μg/mL，充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于10cm，厚度宜为3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔放置在阴极端。向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，液面高于胶面1mm~2mm。将 5μL PCR产物与1μL 6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔，小心上样于孔中；阳性对照的 PCR 反应产物加入到最后一个泳道；第一个泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通电泳仪电源，根据公式：电压=电泳槽正负极间的距离（cm）×5V/cm计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳30min~45min后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果，拍照并记录数据。
可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸荧光染料替代EB。
推荐使用DNA Marker：DL2000或100bp ladder，等可指示100bp~1500bp条带的Marker。
结果分析
阴阳性判读：
进行电泳检测时，需对比Marker进行判断，当目的靶标对应位置出现单一显著条带时可判断该靶标为阳性；否则为该靶标检测为阴性。（使用荧光定量PCR仪检测时，检测孔Ct≤30时判断该孔为阳性；当检测孔Ct＞30时，该检测孔为阴性）
示例电泳图
有效性判读：
需同时满足：1.空白对照中所有泳道均为阴性；2.阴性对照中uidA泳道阳性，其余泳道阴性；2.阳性对照中所有泳道阳性，此时可判断实验有效。如无法满足上述条件，则实验无效，需重复实验；如重复后结果仍为无效，请于本公司技术支持联系。
结果判读：
在实验有效的情况下，可根据下表进行判读：
致泻大肠埃希氏菌类别
目标条带的种类组合
EIEC
ipaH（＋）
uidA
（＋／－）
EAEC
aggR，astA，pic中一条或一条以上阳性
EPEC
bfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－）
STEC/EHEC
stx1，stx2中一条或一条以上阳性，eae（＋／－），bfpB（－）
ETEC
lt，stp，sth中一条或以上阳性
97%以上大肠埃希氏菌为uidA阳性，可参考阴性对照中该基因检测结果判断扩增效果；
当结果判定为EPEC阳性时，若bfpB靶标为阳性则说明样品含有典型EPEC；若bfpB靶标为阴性则说明样品为非典型EPEC；
当结果判定为STEC/EHEC阳性时，若eae靶标为阳性则说明样品含有典型EHEC；若eae靶标为阴性则说明样品为非典型EHEC。
◆ 注意事项
1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。
1）第一区：样本制备区。
2）第二区：扩增及产物分析区。
★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。
2. 实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。
3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。
4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒。
5．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。
