李昌厚：保证分析检测数据可靠性的一些关键问题（二）
在上一篇文章中，我们讲解了3个影响检测数据可靠性的关键问题，在本篇中，李昌厚老师继续为读者讲解剩余4个影响检测数据可靠性的关键问题。
重视和掌握数据处理和数据可靠性判断的具体方法
加标回收率的测定
由于工作中样品溶液与标准溶液基体一致是很难做到的，基体中有无干扰可以通过加标回收实验确定：即在被测样品中加入标准物质，测定其回收率，这是目前国内外各种实验室中常用而又方便确定检测数据可靠性（准确度）的方法。但是，加标回收仍需要注意以下几个问题：
1）若样品浓度小于测定下限时，则加入测定下限（标准系列浓度最低点）的浓度，否则无效。
2）作标准曲线时：实验点不少于5个点(最好7个点)，有人只做3个点不妥，太少了。
3）加标回收时需要加3个水平的添加量，因为回收率视含量不同而有差异。加标点的位置应该是三个（线性范围的两端各一点、线性范围中间取一点）。
重视相关系数r与斜率b的关系，避免误判分析测试数据的可靠性
从仪器学理论和分析化学的角度来看，我们平日所讲的标准曲线又称校正曲线，其理论依据是郎伯－比尔定律。即：
A=KLC
式中：A为吸光度；K为系数；L为光程；C为试样浓度。
现代分析仪器自动化水平都较高，都带有计算机及配套软件。在测定标准浓度溶液后，都能通过计算机自动获得相应的吸光度，根据回归方程y=bx+a，自动给出校正曲线及校正曲线的相关系数（r）、斜率（b）和截距（a）。但吸光度A与试样浓度C之间的关系A=f(C)只是相关关系，只有当r≈1时，吸光度A与试样浓度C之间的关系才可近似地看作线性函数关系，最终根据测得的样品吸光度A值直接由A=f(C)反求试样浓度C值。当r偏离1较大时，则根据测得的吸光度A值直接由A=f(C)反求试样浓度C值将产生较大的误差。所以，注重 r 这个重要数据是对的。
但是，许多科技工作者只是单一的注重 r 这个重要数据，专门追求r值的大小，并且主要根据r值来对检测结果下结论，这就不对了。他们只看r值达到了几个“9”，并且很多科技工作者片面追求相关系数是否达到三个9以上：他们认为r值达到0.999,就算测定结果准确了。这是不对的，为什么？因为多数实验室忽略了斜率的变化。测定中的吸光度是随浓度的变化而改变的，如果浓度不准确，如标样浓度变小，吸光度也随之变小,反之亦然。根据回归方程y=bx+a,斜率b增大,吸光度也随之增大。所以即使相关系数好，测定结果也不一定准确。往往在接受质控考核中会遇到这个问题，我们应引起重视。
例如，测定水中的Mn时，作者和邹宗富等参加国家实验室比对考核时，测试结果雷同：三个实验室对Mn的测试时，相关系数都在0.9996以上，仪器都是使用国产TAS-990，国家给定的标准参考物质浓度：0.16±0.02 µg/mL，三个实验室用TAS-990测定Ｍn的结果：1、2实验室考核合格；3实验室考核不合格。三个实验室测定结果如下表：
表中所示，三个实验室测试结果中，r值都为三个“9”，但是斜率在第三个实验室的测试数据中不正常。最后导致测试结果的浓度也不正常。致使第3个实验室考核不及格。所以r值不能完全代表实验的有效性。
重视测量方法与测量结果的朔源
测量方法至少包括抽样，样品前处理和仪器测定三个部分组成。除样品的代表性（送样只对送样负责、采样对批量负责）、合理的前处理外，还要朔源仪器的检定。当对某样品测定时，无论选用哪种分析方法，都要用化学组成形态与样品相似的标准参考物质同时进行测量，只有标准参考物质的测量结果在证书值给定范围内，才能说明测量结果的可靠性。这也说明了标准参考物质的重要性。
重视标准和标准系列浓度范围的关系
据分析仪器（仪器学理论）和仪器分析（分析化学理论）的理论，很多分析都是相对测量，所以标准特别重要。一般情况下，要求试样浓度应尽量在标准系列的中间。例如食品等需要消解的样品，根据卫生部食品标准方法，AAS石墨炉法测Pb的标系为：10～80 ng/mL。若称样量2 g，经微波消解后定容为10 mL待测，测得的样品Pb的含量，按卫生部标准计算则为0.2（µg）×2（样品量）/10 mL=40 ng/mL。这个结果很好，在标系范围内，并且在标系中间。
注重样品测定值与标准值不一致时的处理判断方法
任何分析检测工作的结果很容易引入误差，测定值往往与真实值不同。因此，一定要重视这些误差对测定结果可能产生的影响，并要控制在一个很小范围内。例如：测定水中的Pb，其测定值为11.0 ng/mL；采用生活饮用水国家卫生标准（10.0ng/mL）衡量，则11.0 ng/mL超标。但是若对10 ng/mL的Pb标准溶液，进行多次测定，其浓度可能在8.0～12.0 ng/mL范围内变化，从测定误差考虑，饮用水中的Pb也可认为11.0 ng/mL不超标，也可以判定合格。所以分析测试工作者对数据的分析和处理结论都很重要。
不同方法的比较
1)当采用不同分析方法对同一样品进行重复测定所得结果一致，则检测数据可靠。
2)采用不同类型仪器（紫外、液相；AAS、滴定等）对同一样品进行重复测定所得结果一致，则检测数据可靠。
3)同一类型的不同仪器（例如不同型号的液相、不同型号的紫外等）对同一样品进行重复测定所得结果一致，则检测数据可靠。
4)用统计学方法检验.统计检验表明，多次测试结果其差异不明显时（或数据在误差要求范围内时），则可认为测试数据可靠。
有些分析工作者在调试国产仪器时，经常使用进口仪器的测试数据来作参照。但他们并不注意比较仪器的档次、仪器的测试条件、被测试样的情况。例如在验收某国产紫外仪器（国产某1901型紫外分光光度计）时，相关方要求一定要用三个月以前、曾用某进口仪器（进口Cary5000型紫外分光光度计）验收测试时用过的样品来做比较。然而，该国产仪器厂商的工程师不清楚进口仪器的型号、档次、测试条件，而且相关方也不提供用于做对比的进口仪器技术指标，只强调国产仪器测试数据、谱图一定要与进口仪器测试的数据和谱图完全一致才行。经过多次调试、检测，这台仪器还是不能达到相关方的要求。
后来，经咨询作者并与相关方讨论协商，最终提出了具体解决方案：一是重新配置同样的样品测试，二是找到原进口仪器比对测试。应作者要求，在找到原比对的进口仪器后、在同样条件下，用这台进口仪器当场再测试存放三个月之久的样品，最终检测结果与该进口仪器原来测试的数据、谱图完全不同，但与当时参与验收的国产仪器现场测试结果（数据、谱图）完全一致。为什么会产生这个现象呢？因为试样放置了三个月，已发生化学变化，自然不可能与三个月以前的测试结果相同。
还有一些药物分析工作者或药检工作者，他们根据药典要求进行药品中重金属元素（致癌物质）的分析检测，并将某些药品在AAS仪器上得到的数据与药典上要求的数据相比较来考核仪器性能。然而，他们并严格不按照药典的要求来配制或处理试样，一旦发现数据不符就下结论说仪器不好，这也是不妥的。为什么？前面说过，试样的处理、配制（称样、量具、溶剂）对分析测试结果有很大影响，如果不注意认真处理试样，极易导致测试数据误差的产生。此外，在仪器条件方面，虽然药典（标准）上有明确的检测方法要求，但是有时药典（标准）未讲明具体仪器条件。因此，一旦发现检测数据与药典（标准）不符时，还要认真改变仪器条件后反复测试，这样才能得出正确的结论。
曾经某医院一位医务工作者要买一台国产专用AAS来测试Cu、Zn、Ca、Mg、Fe，招标时有两家同类国产仪器厂商竞争。为了挑选一台好的仪器，该医院提出要求将这两款专用仪器（价值仅几万元RMB/台）的测试数据与美国PE公司AA-800（价值超过80万RMB/台）检测的数据与进口AAS仪器比较，哪台仪器测试数据与进口品牌仪器最接近就买哪台仪器。而巧合的是进口AA-800正处在故障阶段（稳定性不好），并且还尚未修复，所以这种比较是不妥的，比出的结果是不正确的。
作者在这里再次强调，也恳请大家记住：比较检测结果时，一定要同类、同档次的仪器才可以比较，不能用低档的751UVS测试数据与中、高档仪器TU-1901、Cary6000i的测试数据比较。同样，也不能将一台行业专用AAS仪器测试数据与进口通用高端AA-800检测数据来比较。这个问题应该怎样解决？作者认为：如果这位医务工作者自己配制一个样品，对他来讲是已知的试样，而对这两家国产仪器的竞争者是盲样，将这两款仪器分别对该样品进行测试，看谁的数据与实际值最接近，然后在再综合评价仪器，谁的测试结果好就买谁的仪器，这才是正确的做法。
重视理解仪器性能指标对分析误差的影响
这是所有分析检测工作者必须注重的问题，也是保证分析检测数据可靠性好的最重要的问题之一。作者列举如下几个要点，便于读者理解：
正确理解精度、精密度和准确度的关系
精度、精密度、准确度这些指标大家经常用到，但是很多人仍搞不清他们的关系。有的科技工作者讲：“分析检测仪器中没有准确度一说”；有人认为“精密度或重复性就是准确度”。这些都是错误的概念。精密度或重复性是指的多次测量中的离散性，如：3次或5次测量结果中，最大值与最小值之差即为重复性。精度包含准确度（Accuuracy）、精密度（Precision），这个问题大家也经常模糊不清。准确度则是指实际测量的值与真值或理论值之差，精密度表征重复性或离散性，一般取平均值表示。精密度和准确度是完全不同的两个概念。Owen[9]为了说明准确度和精密度或重复性的区别，为了澄清国际上的错误观念，用打靶的例子作了精辟的说明，详见下图所示：
图中：(a)－精密度和准确度都不好；(b)－精密度好，准确度差；(c)－精密度差，但准确度好；(d)－精密度和准确度都好；又可叫“精度”好。
检测限（又叫检出限）、灵敏度和测定限问题
检测限是表征仪器检测能力的指标，表征仪器的灵敏度。可以指明对某个物质的最小检测量（如HPLC对萘的检测限为10-9 mg/mL等），也可用S/N表示，一般用S/N=2为定性检测限。而定量检测时，有人用S/N=10表征检测限；但是一般用S/N=3（我国很多标准规定用S/N=2），也有用3倍标准偏差作为检测限的。测定限是指能测出的数据，与N无关。检测限和测定限的区别如下图：
标准偏差SD（也可以用σ表示）和相对标准偏差RSD
它们是广大分析检测科技工作者使用最多一个指标，用于表征分析检测的离散性或重复性。但是在具体应用时，很多科技工作者的操作不规范。有人作3次平行数据、有人作5次平行数据，这些都是不妥的。作者认为，做SD测量时应该至少作6次以上，所以有些标准规定平行数据不得少于6次就是这个道理。
相对标准偏差RSD是指在同一条件下，对同一试样多次重复测量，测量结果相互符合的程度或离散性，又叫精密度或重复性。
精密度通常用统计方法来计算；如：对于同一试样，在相同条件下进行多次测量，测出某值Xi，并求出多次测量的平均值X：
此时，标准偏SD（又可以用σ表示）可由下式求得：
式中的σ为标准偏差；n为测定次数， Xi 为第i次测量的值。 X为多次测量的平均值。此时，相对标准偏差一般惯用RSD表示： RSD＝SD/X´100％
当我们的测量次数足够多的时候，SD 遵循高斯定律，SD获得的正负次数大约相等，因此，分析测定的标准偏差也可以用 ±SD 表示。但是作者认为还是不加“±”为好。分析检测人员正确理解和正确运用这些检测仪器的性能技术指标，是用好一台检测仪器的关键，或者说是得到准确可靠分析检测数据的关键。希望广大读者重视这些指标的物理意义的理解，重视对这些指标的自检方法，正确选择和运用这些技术指标。这样才能真正用好检测仪器，保证分析检测数据的可靠性，真正的成为一名合格的检测人员。
重视日常分析检测工作中分析数据处理的常见错误
在日常的分析检测报告中，经常出现表述不妥当或者不规范的现象，大家应该引起重视。
检出结果为“0”、“未检出”
测试结果的表述与测试方法、标准、仪器条件等有关，如果有些国标、行标、企标设定标准为0.003 µg/mL，此时检测报告中的“0”和“未检 出”应写“低于0.003 µg/mL”，绝对不能写“检出结果为0”和“未检出”。如果没有国标、行标、企标，检测人员根据当时的方法、使用仪器型号、选择仪器条件，经过认真检验和判断，在报告中写上检测结果。如果真的检测不出来，可以在报告中写低于仪器检测限（但应给出具体数据：如使用某HPLC，其检测限为萘1.0×10-8 g/mL。此时，对萘的检测报告中可写：低于1.0×10-8 g/mL。但是绝对不能写“未检出”或“0”）。
AAS数据处理值得高度重视
在验收AAS时，经常出现验收单上有指标验收标准值，但没有验收实测值和结论的现象。例如：有人在验收TAS-990F时，用Hg灯的特征波长来测试仪器的波长准确度。他选用三条特征波长：253.7 nm、546.1 nm、871.6 nm，这是对的。然而在“验收实测值”栏里却有9个实测数据，它们是：253.84 nm、253.85 nm、253.85 nm、546.19 nm、546.19 nm、546.20 nm、871.64 nm、871.64 nm、871.65 nm。那么问题出在哪里？第一，标准值（或要求值）只要求小数点后一位（253.7 nm、546.1nm、871.6nm），但实测值为小数点后两位数字（例如：253.84…）；第二，没有结论。在验收实测值这栏中，应该对9个数据进行数据处理（例如取均值），最终得出一个实测结论，最后填写验收实测值的结论值。在这个案例中，结论值应该是±0.2 nm。所以大家一定要重视数据处理这一问题。
很多日常的检测报告中，不注明工作环境条件
例如，我国南方在室温为8℃和30℃时进行测试时，得到的数据是不同的。此外湿度的大小也会影响实际检测的数据。这些细节问题，往往是很多分析测试科技工作者所忽略的，作者认为应该引起实验室管理人员以及检测人员的重视。
重视测定条件选择对测定结果的影响（对误差的影响）
根据仪器学理论，针对不同仪器和不同样品，分析测试人员要选用不同仪器分析条件进行分析，否则误差容易增大。例如火焰AAS有36个条件需要选择，包括选择灯电流、光谱带宽、乙炔流量、燃烧头高度、积分时间等。选用石墨炉AAS法测定时，有48个条件需要选择，可选则参数包括灯电流、光谱带宽、干燥温度、灰化温度、原子化温度、升温速率、保留时间、净化阶段的温度与时间、积分时间等。
上述这些条件都对分析测试结果的误差有绝对影响。所以，相关操作人员一定要从仪器学（理论）和分析化学（实践）两个角度，认真注意选择分析条件。作者根据多年经验，为读者举一个实际检测的例子：一般来讲，测定铁、锰等元素的光谱带宽要求小于或等于0.2 nm，测定铬、锡时，乙炔流量要大一些，一般采用还原性火焰，空心阴极灯发射谱线的光斑要在燃烧头缝隙的正中，且有3～4 mm的距离。在石墨炉法中，除正确选择干燥温度、灰化温度、原子化温度、净化温度等条件外，还要注意标准溶液与样品溶液的浓度，要注意按样品溶液的特点选择最适宜的检测条件。
另外，对测定高浓度（浓度在标准系列浓度直线以外，例如:2～4 ng/mL以上）的钠、钾、锌等样品时，要适当转动燃烧头的角度，并且将高浓度的吸光度控制在0.2～0.5 Abs最佳值以内（即在仪器的线性范围内），其目的是为了控制或减少分析误差。
从仪器学理论和分析化学的实践要求来讲，光谱、色谱等仪器的检测条件选择非常重要[2]。很多研究证明，UVS、AAS、HPLC等仪器的条件选择对最终的检测结果又显著的影响[4、6、8]，作者认为所有人必须认真对待。例如，在SBW分析条件选择上，我国药典过去规定检测青霉素钠等要用1nm光谱带宽。作者对此进行了研究；先后用1.0nm 、0.5 nm、0.3 nm、0.1 nm的SBW测试，结果使用0.3 nm的SBW，测量峰值最高。后来作者报告国家质量技术监督局并提出建议，希望邀请仪器研究和应用领域专家参加制订药典。经过专家研究，最终在新版药典中去掉了1nm光谱带宽的规定。
此外，仪器操作人员特别要重视操作程序，不能着急。作者曾经培养的一位博士生在做AAS分析检测时，在冷却时间还没到时，马上又进样…。结果表面上他的实验完成最快，但实际数据不合格，只能重做。不仅没能在最短时间内得到检测数据，还浪费了宝贵的实验时间。虽然实验技巧大家都知道，但也要重视实验操作程序，顺利完成样品检测。
重视开展分析测试方法学的研究
由于科技创新发展很快，很多工作可以在电脑软件上下功夫，最终得到令人满意的结果。例如：北京西派特的科技工作者，针对任务开展拉曼光谱数据处理的算法研究，得到了满意的效果。西派特应用测试部都是年轻人，并且全部是分析化学背景的技术人员。他们结合任务，大力开展软件算法研究，结果得到了令人想像不到的结果。请看下面的例子[8]：
1. 北京西派特公司在算法上创新、性能实现国际领先水平的EXR510便携式激光拉曼光谱仪实际样品测试谱图：
（1）数据采集和降荧光、降噪处理的结果（谱图）
由于算法上的创新，其效果令人非常满意。这种做法值得引起广大使用者重视。
仪器条件：ExR510 便携拉曼光谱仪； 激发光源：785 nm； 积分时间：10 s；功率等级：10级。
（2）对滑石粉、布洛芬等样品进行定性检测的结果：
从采集光谱图、降荧光干扰、降噪声、与标准谱库自动比对等，最后给出匹配度结果，检测过程全部由仪器自动完成。据文献报道，滑石粉是一种拉曼信号很弱的样品。即便如此，该仪器采用了降噪、降荧光干扰的方法，检测匹配度达到99.9%，定性检测的谱图如下：
①滑石粉定性检测的结果：滑石粉 检测的匹配度：0.999
②布洛芬片定性检测的结果：布洛芬 检测的匹配度：0.928
检测仪器：ExR 510 便携拉曼光谱仪；
激发光源：785 nm；积分时间：10s ；功率等级：10级
③对多组分样品进行定量分析检测的结果：
样品是西派特公司自己配制的；由15mL甲醇、30 mL乙醇和15mL乙二醇混合而成。以此作为已知相对标准样品，测出的结果如下表所示：
为了说明开展算法研究的重要性，作者采用了国产西派特ExR510拉曼光谱仪与美国海洋光学 Accuman PR-500拉曼光谱仪同时对三种同样辅料试样，在相同测试条件下测试的结果如图所示：
上图为美国海洋光学Accuman PR-500测试的结果
上图为中国西派特公司ExR510的测试结果
上图为中国西派特公司 ExR 510对测试谱图进行降噪声、降荧光处理后的结果
经过比对，作者认为由于算法的创新，西派特公司的ExR510激光拉曼光谱仪与目前国内外其它同类产品相比较，具有独到之处。其主要性能指标优于国外同类同档次的产品。所以，开展方法学研究、认真选择仪器条件非常重要，是目前国际上分析仪器及其应用领域的一种潮流，也是当前分析方法创新的潮流，值得广大分析检测科技工作者关注。
主要参考文献
[1]李昌厚，《原子吸收分光光度计仪器及其应用》 ，北京：科学出版社,2006
[2]李昌厚，《仪器学理论与实践》，北京：科学出版社,2008
[3]李昌厚，《高效液相色谱仪器及其应用》，北京：科学出版社,2014
[4]李昌厚著，《紫外可见分光光度计》 ，北京:化学工业出版社,2005
[5]李昌厚，《紫外可见分光光度计仪器及其应用》，北京:化学工业出版社,2010
[6]李昌厚，用好AAS的一些关键问题，分析测试百科网，2020年6月
[7]李昌厚，用好HPLC的九大关键问题，媒体，2020年6月
[8]李昌厚，便携式激光拉曼光谱仪器及其应用的最新进展，媒体，2019年6月
[9]A.Owen ,The diode-array advantage in UV/VISS,Hewllet Packrd,PrinnTED in Germany,03/88,p15.
作者简介
李昌厚，男，中国科学院上海生物工程研究中心原仪器分析室主任、兼生命科学仪器及其应用研究室主任、教授、博士生导师、华东理工大学兼职教授，终身享受国务院政府特殊津贴。
主要研究方向：长期从事分析仪器研究开发和分析仪器应用研究。主要从事光谱仪器（紫外吸收光谱、原子吸收光谱、旋光光谱、分子荧光光谱、原子荧光、拉曼光谱等）、色谱仪器（液相色谱、气相色谱等）及其应用研究；特别对《仪器学理论》和分析仪器指标检测等方面有精深研究；以第一完成者身份，完成科研成果15项。由中科院组织专家鉴定，其中13项达到鉴定时国际上同类仪器的先进水平，2项填补国内空白；以第一完成者身份获得国家级和省部级科技成果奖5项（含国家发明奖1项）；发表论文183篇，出版专著5本；曾经任中国仪器仪表学会理事、中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届、第六届付理事长、国家认监委计量认证/审查认可国家级常任评审员、国家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大仪器及其应用专项的技术专家组成员或组长、上海市科学仪器专家组成员、《光学仪器》副主编、《生命科学仪器》付主编、《光谱仪器与分析》副主编、上海化工研究院院士专家工作站成员等十多个学术团体和专家委员会成员等职。
