RNAi技术
DNA芯片检测siRNA专一性 长片断的双链RNA (dsRNA) 导入例如植物，真菌，果蝇，线虫等生物的细胞中会引发同源mRNA的降解——这就是所谓的RNA interference (RNAi)。RNAi分两个步骤，首先是长片断双链dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25个碱基的small interfering RNAs (siRNAs)。这些siRNA随后和相关蛋白组合成为RNA-induced silencing complex (RISC) ，这个复合物以同源mRNA为靶摧毁mRNA。两年前Elbashir and Tuschl用siRNA在哺乳动物细胞中成功引发特异基因的沉默，从此siRNA广泛应用于这个领域。
siRNA介导的基因沉默通常要求高度的序列专一。Tuschl和同事证实siRNA和mRNA之间一个碱基的错配都会导致基因沉默的失败，当然这并不排除由siRNAs 引发的非特异基因沉默。siRNAs也有可能会引发一系列的部分同源的mRNAs沉默，甚至有可能象超过30个碱基的长片断dsRNA一样通过引发抗病毒反应—— 一种通常由于机体对抗病毒入侵产生的反应，包括由蛋白激酶R和后继的EIF2a磷酸化激活的蛋白合成阻断，以及由 RNase L激活的非特异RNA降解。
这就意味着需要在全基因组范围内对siRNA的专一性进行检测。2003年5月出版的The Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Patrick Brown和同事采用DNA芯片的方法对siRNAs的专一性在全基因组范围内进行了检查。
Brown和同事检查了两个针对外源GFP基因的siRNAs的专一性，结论是关闭外源的GFP表达不会间接影响其他细胞内源基因的表达水平。2个GFP特异的siRNAs和两个随机无意序列对照siRNAs分别被转染能瞬时或者持续表达GFP的人源293细胞，结果通过GFP荧光水平检测和FACS分析，GFP特异的siRNAs能够沉默70%的GFP表达而对照则对GFP表达没有影响。从转染和没有转染siRNAs的细胞中分离RNA，标记后和点有36000个人类基因的cDNA 芯片杂交。其中约有20000个基因在293细胞中表达。结果表明这20000个基因中没有一个的表达水平在转染了特异或非特异siRNAs后发生显著变化。
对于RNAi 特异性的另一个关注焦点是：传递的RNAi（"transitive RNAi"）或者叫'secondary siRNAs'的产生。Transitive RNAi是在线虫的实验中发现的，也可能在其他生物中发生。在这个过程中，siRNAs，在变性后结合到互补的转录本上，通过RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase ，RdRP)在3'和5'端的延伸形成新的双链dsRNAs。这些dsRNAs被加工成为'secondary siRNAs'。这些二级siRNAs，如果和其他基因有同源，可以导致其他基因表达的沉默，这样就强化了非特异基因沉默的可能性。
到目前为止，在人类基因组中没有发现 RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)，这提示在人类细胞中可能不会发生RNAi传递。然而这个假设并没有被广泛的验证过。Brown和同事也检测了在人源细胞中是否存在传递RNAi现象。他们将两个报告基因(luciferase and GFP)分别和常见的actin序列融合，共转染到293细胞中。他们检测到一个报告基因的特异的siRNAs不能导致另一个报告基因沉默。结果表明传递RNAi机制在人类中不存在。
研究结果支持已有的假设：siRNAs在高度序列专一的条件下发挥作用，只能导致完全互补的基因表达沉默。人类细胞不存在传递RNAi现象的实验结果同样证实这种专一性。
不过实验受限于细胞类型和siRNAs类型，特别是外源基因的siRNAs。实验结果仍然有待推广到其他细胞类型，特别是内源基因的siRNAs，如果siRNAs在将来要应用于基因治疗，这样的实验将尤为重要。
RNAi：制备siRNAs的方法
越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs)来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）。RNAi的应用包括功能基因组学，药物靶筛选，细胞信号传导通路分析等等。
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括
· 化学合成
· 体外转录
· 长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
· siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
· PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
前面3种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种方法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有自己的优点和缺点。哪种是最好的方法，其实取决于实验目的。这里简单介绍这5种方法，优点和缺点，以及它们最适合的应用。
siRNA的设计
除了方法3以外，其他的方法都在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。关于怎样设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信息。但这仍然不是精确的。通常来说，每个目标序列设计3—4对siRNAs，在后面的实验中选择最有效的那个。网上有提供免费的siRNA设计工具。
体外制备
1.化学合成
尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.体外转录
通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit为例，一旦得到DNA Oligo模版（这个还是需要DNA合成的，不过DNA合成的成本就比较低了），只要24小时就可以，不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间——毕竟，化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection ，图2）
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
 Figure 2. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs to Induce Gene Silencing. siRNAs targeting ß-Actin were prepared by chemical synthesis (Ambion) or by in vitro transcription using Ambion's Silencer™ siRNA Construction Kit. HeLa cells were plated at 30,000 cells per well in a 24 well tissue culture plate containing glass slides. The cells were transfected 24 hours after plating, using 2 µl siPORT™ Lipid (Ambion) according to the manufacturer's protocol, at a final siRNA concentration of 75 nM. Immunofluorescence analysis was performed 96 hr post transfection using mouse anti-Human ß-Actin primary antibody and a FITC conjugated anti-mouse IgG secondary antibody. Photographs were taken using the appropriate fluorescent filters and quantified using MetaMorph software. Note that both siRNA preparation methods resulted in >_ 95% reduction in ß-actin protein levels. |
3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。Ambion公司曾经用它的Silencer siRNA Cocktail Kit(RNase III)试剂盒成功关闭几个基因，包括c-fos, GAPDH, La, ß-actin, 和Ku-70。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗<span clear:both;="" height:10px;"="" style="margin: 0px; padding: 0px; border: 0px; outline: 0px; font-size: 12px; background: transparent; line-height: 18px;">
