血细胞参考测量实验室的建立

血细胞分析是一种通过一些仪器的检测对红细胞、白细胞等项目进行分析的技术，血细胞分析仪是医院临床检验应用非常广泛的仪器之一，通过血细胞计数分析可以了解患者血液的基本信息。根据国际血液学标准化委员会(International Council for Standardization in Heamatology，ICSH)及临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)颁布的文件要求，血细胞分析的检测结果需溯源至参考方法才能保证结果的可比性和准确性，北京市医疗器械检验所参考测量实验室根据ICSH与CLSI颁布的国际标准，建立了5个项目的参考测量系统，分别是红细胞计数( red blood cell count，RBC count)、白细胞计数(white blood cell count，WBC count)、血红蛋白测定(hemoglobin，HGB)、红细胞压积测定(erythrocrit，HCT)、血小板计数(platelet count，PLT count)。

一、参考测量项目的开展工作

(一)参考方法的建立

依据ICSH和CLSI颁布的参考方法[1,2,3,4]，对血细胞参考测量程序进行查阅和翻译，完成5个参考测量程序的建立，针对各个项目所需的仪器和配套试剂，询问厂家仪器设备的精度和实验条件，购置相关仪器及耗材，派出技术人员到日本和美国的实验室学习参考方法操作[5]。实验初期使用大量新鲜血液样本摸索实验条件和技术细节操作，在改进中不断吸取经验。5个参考测量项目的建立步骤介绍如下。

1．红细胞(RBC):用稀释液将血液稀释一定倍数，使用单通道电阻抗原理的粒子计数仪计算红细胞数值。

红细胞参考测量方法：20 μl定量移液器吸入含有EDTA·K2健康人新鲜血，使用低尘擦拭纸擦去管外壁多余的血液，加入装有1 000 ml稀释液的容量瓶中，容量瓶盖好瓶塞，底部画圆旋转混匀，该操作反复3次使血液在稀释液中均匀散开，将容量瓶中稀释试样注入计数杯中，上机测试。

2．白细胞(WBC):用稀释液将血液稀释一定倍数，加入溶血素破坏溶解红细胞，使用单通道电阻抗原理的粒子计数仪计算白细胞数值。

白细胞参考测量方法：200 μl定量移液器吸入含有EDTA·K2健康人新鲜血，使用低尘擦拭纸擦去管外壁多余的血液，加入装有100 ml稀释液的容量瓶中，再次加入1 000 μl溶血素，容量瓶盖好瓶塞，底部画圆旋转混匀，该操作反复3次使血液在稀释液中均匀散开，静置15 min待其完成溶血反应将稀释试样注入计数杯中，上机测试。

3．血红蛋白(HGB):血红蛋白分子中的亚铁离子在溶液中被高铁氰化钾氧化成高铁离子形成高铁血红蛋白，其后又与氰离子反应生成氰化高铁血红蛋白(HiCN), HiCN在波长540 nm处有最大吸收峰，HiCN吸光度严格遵循朗伯－比尔定律，即HiCN在波长540 nm的吸光度值与HiCN浓度成正比，血红蛋白浓度可由分光光度计所测定的吸光度值计算得出(参见"WS/T 341－2011血红蛋白测定参考方法" )。

血红蛋白参考测量方法：使用100 μl定量移液器吸取含有EDTA·K2健康人新鲜血，将血液加至装有文齐液的25 ml容量瓶中，静置5 min后使用注射器和过滤膜进行过滤去除杂质，滤液静置至少1 min后上机测试。

4．红细胞压积(HCT)：采用微量压积法测量HCT，使用毛细管吸入含有EDTA·K2的健康人新鲜血，在离心机的作用下使得红细胞完全压实在管底端，血浆全部被挤出到血细胞的上面，这时红细胞所占全血的百分比就是所要得到的红细胞压积。

红细胞压积参考测量方法：取毛细管充入含有EDTA·K2的健康人新鲜血，将毛细管垂直插入黏土封闭剂里，查看封口处是否平整，管内是否有气泡，在离心力为(10 000～15 000)×g条件下离心5 min，在显微镜上固定毛细管，使用低倍物镜观察界面读数，计算红细胞比容测定值。

5．血小板(PLT):采用间接法计数PLT。即用荧光标记PLT后，用流式细胞仪检测RBC和PLT的比值，同时用单通道电阻抗原理的粒子计数仪计数RBC，用RBC除以RBC和PLT的比值得出PLT计数值(参见"WS/T 244－2005血小板计数参考方法" )。

血小板参考测量方法：用移液器加5 μl血液、5 μl CD41a抗体、5 μl CD61抗体至试管底部，将过滤的100 μl含有牛血清白蛋白的平衡盐缓冲液(PBS－BSA)加入上述试管，避光条件下放置15 min，再加入4.85 ml含有牛血清白蛋白的平衡盐缓冲液(PBS－BSA)稀释液制备成1∶1 000的稀释标本，使用流式细胞仪测出RBC和PLT的比值。

(二)人员技术能力培养及实验比对工作

为提高操作人员的能力水平，在参考测量系统建立初期，每周有1天组织人员进行新鲜血样本的实验比对，每个项目规定2人操作，每次使用1～3支血液样本，按照室内规定的人员间比对要求判定是否合格，实验结果不符合比对要求时，组织人员讨论并查找原因，避免因人员操作问题影响检测结果。实验室间比对是借助外部力量来提高实验室能力水平，识别实验室存在的人员能力和设备校准等问题，北京市医疗器械检验所参考测量实验室采用质控品以及新鲜血样本两种物质进行室间比对实验。新鲜血样本室间比对一般在1 d内完成测试，各个实验室分布在不同城市时，应在样本到达目的地后方可同时开展实验，保证各方测试样本时间上的一致性及数据的准确性。

(三)日常质控实验及规则

粒子计数器及血液分析仪需用质控品检查仪器的性能指标，如何来确定测得的质控品数据准确可靠？可使用Westgard多规则和用Levey－Jennings质控图结合来判定数据的失控限，常用质控规则12 s；13 s；22 s；R4 s等(图1)。实验室可根据室内质控品使用程度拟定适合自己的质控规则，供应商提供的质控品靶值作为参考，不可作实验室的定值范围。每使用一批新的质控品测试时，应根据多批数据获得的质控测定结果，进行离群值检验，计算出均值和标准差，作为暂定靶值，当出现失控时，可根据以下方法查询原因：(1)回顾实验操作过程是否错误，查看仪器状态等确认无误，复查数据结果；(2)重新测定同一质控品，如果是偶然误差则可确定重测的结果在允许范围内，反之则进行下一步操作；(3)重新打开一瓶同批号的质控品，如果数据在允许范围内，则原来的质控品有可能长时间使用被污染或储存的时间、位置等因素导致数据不符合；(4)如果以上(1)～(3)都未在在控范围时，请厂家技术人员提供技术支持。

(四)测量不确定度的评定

自2011年底至今，汇总所有新鲜血样本数据，分析5个参考测量项目的不确定因素，尽可能降低来自试剂、前处理步骤对结果的影响；通过严格按照数值修约和统计计算等标准来规范数据处理部分；通过室内外每周两次的精度管理、定期的维护校准降低来自标准器波动的影响；通过冲洗操作降低仪器空白背景，混匀操作减小样本不均匀性的影响，监测计数时间来监测仪器状态等方式，尽可能消除这些测量因素对结果的影响等多方面计算出扩展不确定度。

(五)仪器的校准管理

每一台仪器应有合格标签，标签内容有该仪器的计量日期及计量效期，一般计量周期为1年。因参考测量项目中需用到带有刻度的玻璃器具进行定量，体积的差异是影响细胞计数的因素之一，因此所使用的玻璃器具(容量瓶、比色杯、量筒等)均应贴有计量标签。

二、质量管理体系的建立

1．质量管理体系文件层次归类及编写：

质量管理体系是组织内部建立的、为实现质量目标所必需的、系统的质量管理模式，它将资源与过程结合，以过程管理方法进行的系统管理。质量体系文件应分为四层：(1)质量手册；(2)程序文件；(3)作业指导书；(4)记录表格。北京市医疗器械检验所参考测量实验室把红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白测定、红细胞压积测定、血小板计数依据GB/T 19702－2005《体外诊断医疗器械　生物源性样品中量的测量　参考测量程序的说明》(等同于ISO 15193：2002)格式编写，归为第3层文件，并且针对各个环节(例如：采购和仪器验收、计算机保护、样品管理等)编写了36个程序文件。

2．文件的管理：

文件的基本类型划分为内部文件和外来文件，内部文件按类别分为管理文件和技术文件，按照类别进行唯一性标识方可留档保存。管理文件可上传至单位内部系统中，根据授权人员不同，应在内部系统中设置，方便工作人员及时查阅打印。每半年进行1次保存，保证文件的更改及时有效。收到外来文件可在纸质上标有接收日期及编号，把文件的题目、发送单位、接收人等信息登记在"外部文件登记单"上。

3．人员管理及授权范围：

实验室里每个人员不管是职位还是操作项目都应由最高管理者授权，包括最高管理代理人、技术负责人、质量负责人、内审员等，需用书面形式及最高管理者签字的方式证明授权人员。人员管理应从以下几方面考虑：(1)选配人员：可根据人员的学历背景、工作专业等信息选择正确的人员到相应的岗位上，才能促使整个团队更好、更快的发展；(2)人员培训：通过外部培训班或各相关专业领域实验室的座谈探讨，或者内部技术人员的问题讨论促使人员要不断地探索并积累经验。

4．质量控制报告：

无论是室内质量控制还是国内外比对的实验数据，都应该形成书面报告存档。室内质量控制的报告内容可包含：(1)实验目的；(2)使用试剂、仪器、质控品等信息；(3)判定方法及依据；(4)质控图；(5)实验总结及讨论。所有的原始记录可作为附件附在报告中，以便追溯，原始记录中有手写部分的需要实验人员和核验人员签名。当实验结果不符合室内规定的要求时，应分析原因进行纠正，填写纠正措施等有关记录表。

5．质量体系文件的不断完善：

运行质量体系文件前应对实验室人员宣贯，了解掌握文件中涉及的内容，明确各自的岗位和职责，实验中应严格按照体系文件的规定操作和实施，原始数据记录保存妥当以便查阅。运行一段时间后按照规定的时间开展内部审核和管理评审活动，通过此次活动真正的认识到文件规定的问题，对体系文件进行修订不断完善，修订过程中按照文件规定流程办理。

三、结语

质量管理体系的运行是数据可靠性和准确性的保障，在运行中发现问题，在纠正中反思问题，不断的改进完善是长期的任务，技术与质量密不可分，共同把握才能推进血细胞参考测量实验室的建立和成长。