RFLP标记技术
实验概要
DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，amHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。
主要试剂
1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。
2、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。
3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方见第九章。
6、0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。
实验步骤
（一）Marker DNA ( λ/Hind Ⅲ)标记
1. 取2ul (1-10ng) marker DNA 于1.5ml离心管中, 再加入13ul水, 在沸水中煮7分钟。取出后，迅速放于冰浴中, 数分钟后离心。
2. 在上述离心管中依次加5ul 寡聚核苷酸(olb)、2ul 牛血清蛋白(BSA)和2ulKlenow酶。
3. 加2.5ul P32(dCTP)后，置室温中5hrs或37℃温箱中1-2hrs进行标记。
4. 标记完成后，加1 X TE 至500ul。
（二）探针标记
标记探针时，每1－2张膜的探针DNA用量为25ng 。标记方法同上，但最后不用1´ TE稀释至500ul。
（三）洗膜(Stripping)
已用过的杂交膜，再做杂交前需要洗去原杂交探针, 方法如下：
1. 洗膜液的配制：于40ml热水中分别加入10ml 20´ SSC和50ml 20％SDS，定溶至2000ml(0.1´ SSC, 0.5%SDS)。
2. 洗膜：将约1－2升（视膜多少而定）洗膜液加热至沸腾，杂交膜放人洗膜液中，在大于95 ℃条件下洗5分钟。按同样方法，重复洗3次。
3. 2´ SSC漂洗：将洗好的杂交膜放人2´ SSC 中漂洗几分钟后，用滤纸将杂交膜吸干，保鲜膜包好后置于-20℃或4℃冰箱中备用。
（四）预杂交：
1、预杂交液的配制：于50ml大离心管中分别加入水(6)、5´ HSB(2)、 Denhardt?s(1)Ⅲ, 混匀后置65℃ 水浴中。各种溶液用量视杂交膜的多少而定。(见下表）
预杂交液的配制及用量
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1-2膜 3-6膜 7-10膜
ddH20 6 12 18
5´ HSB 2 4 6
Denhardt 1 2 3
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2、carrier DNA(鲑精DNA)变性：将盛有carrier DNA 的离心管放入沸水中煮7分钟，变性后迅速放于冰浴中。
3. 待50ml大离心管中的预杂交液澄清后, 加入300ul（9ml预杂交液）、 600ul(18ml）、900ul（27ml）变性后的carrier DNA,混匀后倒人杂交盒中。
4. 将杂交膜放人杂交盒中，并使预杂交液浸匀杂交膜。封好杂交盒后置65℃温箱中振荡5－6小时（新膜）或2小时（旧膜）。
(五) 杂交
1. 将标记好的探针用1´ TE 稀释至50ul。
2. 探针变性：加入5ul(1/10 体积)3 N NaOH变性5分钟。
3. 杂交：将预杂交后的杂交膜从杂交盒中取出，将适量的标记好的marker DNA(λ－/HindⅡ)和变性好的探针加入预杂交液中混匀。然后将杂交膜放入杂交液中浸匀。封好杂交盒后，置65℃温箱中振荡过夜。
(六). 洗脱：
1. Ⅰ型洗脱液配制及洗脱：
洗脱液I： 2´ SSC, 0.5% SDS
洗脱液II：0.2´ SSC, 0.5% SDS
分别取200ml 20´ SSC 和50ml 20％SDS于1000ml 量筒中，取1000－2000ml 加热至65℃，小心将膜转入洗脱盒中，并加入少量洗脱液漂洗，然后倒入全部洗液，65℃振荡洗脱15分钟。然后再洗第二次，方法同上。若膜较多，应将膜上下翻动。
2. Ⅱ型洗脱液洗脱：用65℃1000－2000mlⅡ型洗脱液洗脱两次，方法同上。
3. 包膜：用滤纸将膜吸干，然后用保鲜膜包好，（注意：除去气泡）
(七) 放射自显影
将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, 于暗室中将 X-光片放于杂交膜上，再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-70℃超低温冰箱中曝光10天左右。
注意事项
1、绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。
2、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。
