脐带和脐血来源干细胞的培养实验
脐带和脐血的准备
从脐静脉分离干细胞
种植法从Wharton胶中分离干细胞
种植法从Wharton胶中分离干细胞
酶消化法从Wharton胶中分离干细胞
| 实验方法原理 | |
|---|---|
| 实验材料 | 脐带 |
| 试剂、试剂盒 | 培养基：脐带运输培养基：Eagle基础培养基（EBM) 添加300 U mL青霉素 300 μg mL链霉素 150μg mL庆大霉素和lμg mL两性霉素B。 MSCs培养基：含2 mmol L的左旋谷氨酰胺的低糖DMEM(LG-DMEM) 添加10% 热灭活胎牛血清（FBS) 100 U mL青霉素和l00μg mL链霉素。 |
| 仪器、耗材 | 夹子 针头 注射器 |
| 实验步骤 |
(a)出生后，用两个夹子在近新生儿的末端和近胎盘的末端夹住脐带以封闭脐带; (b)剪下两个夹子间的脐带，一端在接近新生儿处，另一端剪去胎盘； (c)剪下脐带后放入运输培养基中送去实验室，整个处理过程在6〜12 h内。 (a)夹住脐带，尽可能靠近新生儿处剪断脐带。 (b)用Betadine或70%酒精的棉花擦拭针头插入位点，位点在脐带近胎儿末端。 (c)为了收集到最大量的脐血，脐带的处理动作要尽可能小。 (d)接着用收集袋或50mL注射器的针头插人步骤b中处理好的脐静脉插人位点。 (e)将收集袋保持在低于插人位点水平，以利于脐血在重力作用下流人容器中，或者用50mL注射器缓慢地将脐血从跻静脉内抽出。尽量多地收集脐血，一般能收集到60〜150mL。 (f)如果出现静脉滑脱，可沿脐带稍向上处用Betadine或70%乙醇消毒后重新插入针头。 (g)血流停止后，打开针头安全帽，将它推入锁定位置。注意：脐血应该保存于室温，不要冷藏。 (h)如果使用袋装，用附带的卡环夹住管子，尽可能接近血袋处打两个安全结以防止泄露，然后剪去针头，将针头放人尖头容器中丢弃。 (i)轻轻转动血袋或注射器几次，使脐血与抗凝剂充分混合
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| 注意事项 | |
| 其他 |
其他试剂： 灭活胎牛血清（FBS)，100 U/mL青霉素和l00μg/mL链霉素。 用于造血干细胞的IMDM：含2 mmol/L的左旋谷氨酰胺的IMDM，添加1% 牛血清白蛋白，10μg/mL胰岛素，0.l mmol/L 2-巯基乙醇，50 U/mL青霉素和50μg/mL链霉素。 用于造血干细胞和MSCs共培养的IMDM:IMDM添加10% 热灭活FBS,100 U/mL青霉素和 100μg/mL链霉素。 用于脐带血来源多能祖细胞的DMEM：含2 mmol/L的左旋谷氨酰胺的高糖DMEM (HG-DMEM), 添加10% 热灭活胎牛血清（FBS)，l00 U/mL青霉素，l00μg/mL链霉素和100 ng/mL粒细胞巨膝细胞-集落刺激因子（GM-CSF)。 PBSA:Dulbecco’sPBS溶液A(无钙镁离子)、过柱缓冲液：pH7.2的PBSA，添加0.5% 牛血清白蛋白和2 mmol/L EDTA或0.6%枸橼酸葡萄糖 A方（ACD-A）。用真空装置除去缓冲液中的气体。ACD-A: 枸橼酸葡萄糖A方（0.6%ACD-A)和0.5% 的牛血清白蛋白（第 V 组分）。胶原酶 A，0.1% 用 PBSA 配制胰蛋白酶，0.05% 胰蛋甶酶用 PBSA 配制，含 0.53 mmol/LEDTA;2.5% 胰蛋白酶用 PBSA 配制。抗凝血剂：枸橼酸葡萄糖腺苷（CPDA-1):122 mmol/L(26 g/L) 枸橼酸钠，0.142mol/L (25.5 g/L) 葡萄糖，15.6 mmol/L(3.0 g/L)枸橼酸和18.3 mmol/L(2.2 g/L)磷酸二氢钠。
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