反硝化细菌的筛选及培养条件的研究
微生物在自然界氮素循环中起着重要作用，如固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用( denitrification ) 。其中，硝化作用与反硝化作用维持自然界氨的平衡及氮的正常循环。 氨化作用由氨化细菌或真菌的作用将 有机氮分解成为氨与氨化合物， 硝化作用由亚硝酸盐 细菌和硝酸盐细菌将氨化合物氧化为亚硝酸盐和硝 酸盐；反硝化作用也称脱氮作用，由微生物在厌氧或 微厌氧条件下将硝酸盐还原成氧化亚氮或氮气。反硝化作用对于控制水体富营养化，处理污水和净化水域有着极大的利用价值。目前已发现某些植物、真菌和细菌都具有反硝化作用。已知有50以上的微生物 能够进行反硝化作用 ，其中绝大多数是细菌。
反硝化细菌 ( denitrifying bacteria )通过诱导产生硝酸还原酶和亚硝酸还原酶对硝酸盐和亚硝酸盐进行还原。不同反硝化细菌的反硝化作用能力不同，生长条件也存在很大差异。作者从玉溪红塔集团技术中心生理生化实验室筛选出的45株具有反硝化作用的细菌菌株中， 进一步筛选具有较强反硝化作用能力的菌株，并对目的菌株的最适培养基、生长温度及好气性进行测定 ，为反硝化细菌的利用提供依据。
l 材料与方法
1.1材料
1.1.2培养基及制备
1.1.2.1斜面培养基
牛肉浸膏蛋白胨培养基。
1.1.2.2 Giltay培养基
A溶液 ： KNO3 1.0g ，天冬酰胺1.0 g ，1％BTB酒精溶液5 mL ，蒸馏水500 mL 。
B溶液： 柠檬酸钠8.5 g ，MgSO4· 7 H 2O 1.0g ， F e Cl3·6 H 2 O 0.05g ， KH 2 PO4 1.0g ， CaC12· 2 H 2O 0.2g ， 蒸馏水500 mL 。
混合A、 B两溶液调节 p H值为7.0～ 7.2 ， 分别装入 250 mL三角瓶，每瓶150 mL， 灭菌备用。
1.1.2.3待筛培养基
硝酸盐培养基：牛肉浸膏3g ，蛋白胨5 g ，KNO3 ( NaNO3 ) 1 g ， 蒸馏水1000m L
反硝化细菌培养基：KNO32 g ， MgSO4·7 H2O 0.2 g ，K2HPO4 0.5 g ，酒石酸钾钠20g ，蒸馏水1000 mL 。
Y B培养基。
调节待筛培养基和YB培养基pH为7.2 ，分别装入250 mL三角瓶， 每瓶150 mL， 灭菌备用。
1.1.3仪器与器材
自动化学分析仪， CO2 培养箱，血球计数板，摇床。
1.2方法
1.2.1菌株反硝化作用能力的测定
1.2.1.1产气特性测定
参考Giltay方法测定反硝化作用菌株的产气特性 ：
将制备的 Giltay液体培养基，加入大试管 ( 20mm×200 mm)中，把缠有细线的小试管 ( 12 mm×75mm ) 倒立放入大试管中，将小试管中的气体排净，塞住大试管，留部分细线在大试管外，便于小试管的提升和降落，灭菌备用。
用 Giltay液体培养基2 mL洗下活化后的菌株， 转入盛有小试管和 Gi l t a y液体培养基的大试管中，将小试管提升一段距离，以便接收气体，接种时注意不要使小试管内进入气体。每个菌株接4支试管，3 0℃ 恒温培养 1 0～1 4 d ， 观察结果。重复 3次。
1.2.1.2硝酸盐降解能力的测定
将产气试管内的培养基滤纸过滤，取滤液，用蒸馏水稀释100倍 ，以自动化学分析仪检测培养基中的含氮量，测定菌株的反硝化作用能力，重复3次。 以灭菌后的培养基作为对照。
1.2.2菌株适宜培养基及好气性测定
将筛选出的菌株在斜面上3 0℃培养1 d后，用10m L无菌水洗下，振荡混匀。分别转接1mL洗下的菌液于灭菌的硝酸盐培养基、反硝化细菌选培养基和 YB培养基中。每个处理都分别在摇床和CO2培养箱( CO2浓度为20％) 中，30℃振荡培养1d。稀释平板法测定筛选菌株的最适培养基及好气性。重复 3次。
1.2.3生长温度的测定
设20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等 5种温度梯度，30℃YB培养基培养1 d ，稀释平板法测定菌株生长的最适温度。
1.2.4菌体浓度的测定
设18、21、24、27、30、33 h等7个时间梯度，30℃YB培养基培养，用血球计数法测定所筛菌株在最适 生长条件下菌体的最高浓度。
2 结果与分析
2.1菌株反硝化作用强度的筛选
2.1.1产气测定
在接种B88、B237菌株的试管内，2d后培养基开始变蓝，并有少量气体产生，滞留在小试管中；3d后培养基由绿色变为蓝色，小试管内的气体明显增多；接种3～4 d后，产气的速度最快，气体量最多，以后几天则看不出气体量的增加。接种其他菌株的试管内，培养基颜色由上向下逐渐变蓝 ，但不产气。
利用Giltay培养基法筛选菌株，试管中的培养基由于反硝化细菌硝酸还原酶的作用 ， 硝酸盐还原为亚硝酸盐，使培养基呈碱性，培养基颜色由绿色变为蓝色。反硝化作用较强的菌株通过亚硝酸还原酶的作用，亚硝酸盐进一步还原成氧化亚氮或氮气， 滞留在小试管中。在45个供试菌株中， B88和 B237菌株能够较好地降解培养基中的硝酸盐和亚硝酸盐，产气早，速度快，3～4 d产气达到高峰，表明其反硝化作用较强。其他菌株虽然也都能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，但不能进一步还原亚硝酸盐，反硝化作用较弱。
2.1.2菌株降解硝酸盐特性的测定在接种B88 、B237的培养基中，含氮量明显降低，表明 B88 、 B237菌株具有较强的反硝化作用，能够有效降解培养基中的硝酸盐 ，见表 1 。
表 1 菌株反硝化作用效果测定( r=0.99921 ， 100 m g·L-1 )
|
项目 |
B88 |
B237 |
CK |
||||||
|
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
|
|
含氮量% |
0.0015 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
0.001 |
0.0015 |
0.065 |
0.068 |
0.070 |
|
平均值% |
0.0013 |
0.0013 |
0.0677 |
2.2培养基及好气性测定
由于反硝化细菌是在厌氧或微厌氧的条件下通过硝酸盐诱导产生的硝酸还原酶和亚硝酸还原酶进行反硝化作用，因此，大多数研究人员在实验室培养反硝化细菌时，多在微厌氧条件下进行。但本试验结果表明，不管有无硝酸盐的诱导，B88、B237菌株的快速生长是好气性的，生长受氧气供应量的限制，CO2含量 (20％)的提高，对菌株的生长具有较强抑制作用； 在不同培养基上，其生长速度差别较大；在反硝化细菌培养基上生长速度反而慢 ， 而在 Y B培养基中的 生长速度快，表2 、表 3 。
表 2 在恒温箱、 CO2培养箱内不同培养基对B 8 8菌株生长的影响
|
培养环境 |
测定项目 |
硝酸盐培养基 |
反硝化细菌培养基 |
YB培养基 |
|
恒温箱 |
稀释倍数 |
105 |
103 |
105 |
|
菌液浓度/个·mL-1 |
3.2315×107 |
3.6×105 |
10.96×108 |
|
|
CO2培养箱 |
稀释倍数 |
105 |
103 |
103 |
|
菌液浓度/个·mL-1 |
1.6×107 |
1.0×104 |
9.485×105 |
表 2 在恒温箱、 CO2培养箱内不同培养基对B237菌株生长的影响
|
培养环境 |
测定项目 |
硝酸盐培养基 |
反硝化细菌培养基 |
YB培养基 |
|
恒温箱 |
稀释倍数 |
105 |
104 |
105 |
|
菌液浓度/个·mL-1 |
3.2×107 |
4.98×106 |
9.2×107 |
|
|
CO2培养箱 |
稀释倍数 |
105 |
105 |
104 |
|
菌液浓度/个·mL-1 |
8.4×106 |
7.6×106 |
4.4532×106 |
2 ． 3生长温度测定
温度对B88、B237菌株的生长速度有显著影响， 在好气条件下，用YB培养基振荡培养，菌株在20℃～40℃之间均能较好地生长，3 0℃左右为最适生长温度。
2.4生长浓度的测定
反硝化细菌经过缓慢增长期和指数增长期后，由于营养的消耗和细菌之间的抑制作用， 菌体衰老、 消解，细菌浓度逐渐降低。B88菌株在最适培养条件下最高生长浓度为6.1×1 0 个·mL-1，B237菌株在最适培养条件下最高生长浓度为1.54×108个· mL-1 。
3 结论与讨论
反硝化细菌主要应用于工业废水或污染河流、池塘的水处理，降低水中的有害含氮物质， 改善水质。反硝化细菌的培养，一般采用专用的反硝化细菌培养基。但不同的反硝化细菌好气性不同、并且不同碳源、pH值、温度、培养基成分对反硝化细菌的生长有很大影响。在常用的反硝化细菌培养基中，筛选最适生长的培养基，对于细菌的富集培养及工业应用具有重 要意义。
常规 Giltay培养基法筛选反硝化细菌使用规格为15 mm×150 mm的试管和杜哈姆管，这样滞留在杜哈姆管的气体量少，也不容易收集。本试验用20 mm×200 mm的大试管，用 12 mm×75 m m的小试管代替杜哈姆管，并将小试管用细线缠绕悬挂，有利于滞留更多的气体，并且容易收集，也更有利于对气体成分进行检测。采用常规方法，从4 5株反硝化细菌中筛选出 B88 、 B237两株反硝化作用较强的菌株，从几种常用的反硝化细菌培养基中筛选出适合菌株生长的 YB 培养基，并确定菌株最适生长温度为3 0℃ ，以及菌株在Y B培养基中生长的最高浓度：B 8 8为6.1 ×108个·mL-1 ； B237为 1.54×108个 · mL-1 。
B88 、B237菌株的鉴定及其在工业上应用有待于进一步研究。
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