DC(树突状细胞)的制备方法（二）
【注意事项】
1.DC 的来源：
DC有多种来源，包括外周血单核细胞（Monocyte）、脐带血 CD34+细胞、骨髓和胎 肝等，但因外周血单核细胞最容易获取、数量也最多，所以临床上被广泛用作 DC 的来源细胞。
2.DC 的成熟度：
我们知道，DC 有未成熟和成熟两种状态，即 iDC 和 mDC，而 DC 的抗原递呈能力 与其成熟状态密切相关。
iDC 的抗原摄取和加工能力较强，但抗原递呈能力很弱。在体外培养时，iDC 去除 细胞因子(即 GM-CSF 和 IL-4)后，会逆转为巨噬细胞，且即使在细胞因子的维持下，未 成熟 DC 的功能也不是激活 T 细胞，而是抑制 T 细胞的增殖。
mDC 则正好相反，其抗原摄取和加工能力很弱，但具有很强的抗原递呈能力。因 而可以激活 T 细胞，引起免疫反应。而且 DC 成熟后即使在培养体系中去除细胞因子， 仍能保持 DC 的状态和功能，不会发生逆转。
因此可以看出，DC 必须完全成熟后才能用于免疫治疗。
3.DC 的无牛血清培养：
DC 最初都是在含有小牛血清（Fetal Calf Serum，FCS）的培养体系中获得的，但我们 知道，如果想将 DC 应用于临床治疗，则不能使用 FCS。然而如果不用 FCS，DC 则无 法培养成功。科学家最先想到的是用 10%的人自体血浆来替代 10%的 FCS，但实验结果表明，人单核细胞在含 10%人自体血浆的培养液中培养，用 GM-CSF 和 IL-4 诱导 7 天后，大多 数单核细胞仍贴壁，半悬浮的 iDC 数量非常少。后来经过不断摸索发现，在无血清培 养基中添加 1%人自体血清对于从单核细胞诱导成为 iDC 效果最好。更为困难的步骤是如何在无牛血清培养体系中将 iDC 诱导成为 mDC。TNF-α和 IL-1β 在含牛血清培养体系中均是很好的 DC 成熟诱导剂，而在无牛血清培 养体系中，两者均无效或效果微弱，即在无牛血清清培养体系，TNF-α和 IL-1不能将 iDC 诱导成为 mDC，或仅能诱导一小部分 iDC 成为 mDC。
后来的研究表明，用单核细胞条件培养基（Monocyte-conditioned medium，MCM）， 即单核细胞在包被有免疫球蛋白的细菌平皿上无牛血清培养 24 小时后得到的培养上清， 可在无牛血清培养体系中诱导 DC 的完全成熟。因此认为，1%人自体血浆+ MCM 可能 成为临床上获得成熟 DC 的标准方法。
但每次制备的 MCM 的一致性很难保证，导致每批 MCM 必须经过测试后才能确定 最适用量，这给临床应用带来阻力和不稳定性。所以，人们一直想寻找到能够替代 MCM 的化学成分明确的成熟诱导组合。
1997 年，德国美因茨大学（Mainz University）的 Jonuleit 等取得了突破性进展，他们 发现 TNF-α，IL-1β 和 IL-6 三种细胞因子的组合可完全替代 MCM，在无牛血清培养体 系中能够将 iDC 诱导成完全成熟的 DC。
4. PGE2 与 DC：
德国美因茨大学的
Jonuleit 在证明 TNF-α，IL-1β 和 IL-6 三种促炎症因子的组合可 完全替代 MCM，在无牛血清培养体系中能够将 iDC
完全诱导成熟的同时，也发现另一 种炎症介质，即 PGE2 可进一步提高 DC 的产量、成熟度、迁移能力和免疫激活能力， 也就是说在
TNF-α，IL-1β 和 IL-6 之外添加 PGE2 可获得更为成熟和高效的 DC，这样 会提高临床上 DC 的治疗效果。
PGE2 常被加入 DC 成熟诱导组合中最重要的原因是其可提高成熟 DC 的迁移能力， 这样可使 DC 更容易到达淋巴结，从而引起免疫反应、治疗肿瘤。但我们也应该注意以下几点：
1） PGE2 不能添加到 DC 诱导分化的 Step 1 中，如加入，DC 的分化将会被抑制；
2） 我们知道，能诱导机体产生 Th1 反应的 DC（很多文献中称为 DC1）有助于多种 肿瘤，如黑色瘤和恶性胶质瘤等的治疗。
实验研究表明，在成熟诱导因子(TNF-α/IL-1β)中加入 PGE2 倾向于将 iDC 诱导 成为成熟的
DC2，而非 DC1，该 DC 会诱导产生 Th2 反应。所以很多人在试图 寻找能够诱导 DC1 的最佳成熟诱导组合，如
TNF-α/IL-1β/IFN-α/IFN-γ/poly-I:C，
TNF-α/IL-1β/IFN-γ/PGE2(低浓度)/R848(TLR7/8 激动剂)和 IFN-γ/LPS 序贯组合
等，但这些新组合都未得到临床上的充分验证，也就没有真正用于临床级别 DC 的制备。
3） 其实，各家的研究结果不尽相同。比如，TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2 组合的创立者
---德国美因茨大学的 Jonuleit 在研究时就发现，添加 PGE2 诱导成熟的 DC 在刺 激 T 细胞时可显著提高其分泌的 IFN-γ 产量，而对 IL-4 和 IL-10 的分泌无影响， 提示添加 PGE2 诱导成熟的 DC 具有诱导 Th1 反应的倾向。
总之，培养体系中是否加入小牛血清，以及所使用的无血清培养基种类不同等诸多 因素都可能导致添加 PGE2 诱导成熟的 DC 在性质上的差异，因此临床上制备 DC 时最 好能够做充分的前期研究，然后确定用于治疗某种肿瘤最好的制备方法。
【DC的制备】
1. 外周血单个核细胞的采集
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞 80 - 100ml；
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
1.3 无血清培养液洗涤 2 次，获得纯度在 90%以上的 PBMC，细胞数量需达到 1-3 x 108。
2. (可选步骤) 肿瘤抗原的制备
用于负载 DC 的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
用 TSA 或 TAA 负载的 DC 具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性 抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全 细胞抗原负载 DC 可克服这些缺陷，因为此时无需知道哪些抗原是肿瘤细胞的 TSA 或 TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击 DC 可诱导产生针对不同抗原决定簇的细 胞毒 T 淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
肿瘤细胞全抗原负载 DC 的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载 DC、用凋亡肿 瘤细胞负载 DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载 DC，用肿瘤活细胞负载 DC，和将肿瘤 细胞与 DC 融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载 DC，因该方法简单、 快速、有效。
反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
2.1 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
2.2 无菌生理盐水洗 3 次；
2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入 RPMI 1640 培养基，充分研磨；
2.4 200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
2.5 用 RPMI 1640 培养基重悬细胞至 1-2 x 107/ml，装入 5ml 无菌冻存管中；
2.6 将冻存管浸入液氮中速冻，10 min 后取出，再迅速放入 37oC 水浴中解冻 10 min。 反复 3-5 次；
注：也可以-80oC/37oC 反复冻融 3-5 次。
2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心 10min；
2.8 收集上清，0.22m 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
2.9 -80oC 保存备用。
