药物分析新技术和进展（二）
1.以TLC,HPLC等分离制各为基础的分析方法
这一类方法主要包括代谢物的分离,检测,纯品制备与结构鉴定几方面的工作.药物的分离检测,主要方法有柱色谱,TLL,Gc与叩凹 叩比常用于药物及其代谢产物的同时分离与检测.根据药物代谢的一般规律,代谢物的极性较原药大,所以在反相叩比系统中代谢物一般先于原药被洗脱出来,特别有利于代谢产物的识别.与BP—叩阳台的检测方法主要有电化学方法(EC),荧光检测(四),紫外吸收检测
(W)与放射性检测(肌).二极管阵列检测器(则)由于能同时进行多波长检测,并问步记录色谱峰的吸收光谱,检测峰纯度,与叩U配合,已成为快速分离检测未知代谢产物的有力工具,适合于体外代谢研究的代谢条件的优化,以及体液中未知代谢产物的分离检测柱色谱,TIj,制各HN—L由于样品容量大,操作条件灵活,适合于代谢产物的制备与纯化 对体外,体内代谢进行色谱分离前,需要对样品先进行提取分离,必要时先做去蛋白处理.常用的提取方法合液液提取与洒固提取.液液提取中常用的溶剂有乙酸乙酯,::氯甲烷,氯仿,乙醚等.根据药物及其可能形成的代谢产物的性质,可能需要调节溶液的PH值,或加入离子对试剂等.以尽可能全囚地提取出主要代谢产物.液固提取由于需要的溶剂量相对较少,提取时没有乳化现象,提取的代谢物极性范围较广等优点,而R益受到重视.常用的因相提取材料合5ep—PaLCl8柱,XAI)2,比nd E1叭校等 而M(;K(3rniHg争"介绍的盐—溶剂对提取法,适合厂多种生物体洒中弱酸件,中性,碱性代谢物的提取,并且问收率高.
分离制备得到的代谢物纯品的结构鉴定主要借助于紫外,红外,核磁共振,质谱等手段.由于代谢物的结构与原药密切相关,因此比较它们波语信息的异同,可以推断代谢产物的化学结构.质谱中各种软电离技术.如场解吸(凹),快原子轰击(F朋)等的使用,有利于提供代谢产物的分子量信息.氢NMR谱,碳NMR诺以及其它有关的NMR谱,如NoE等效术在药物代谢产物研究小已有广泛的应mL"'81,能够提化有关代谢产物分子结构较为详尽的信息,能够用于区别体置异构体及立体异构体。
2.色谱—质谱联用分析方法
色谱—质诺联用方法由于将色谱的高度分离能人与质谱的高检测灵敏度,定性专属性集于一身,已在药物代谢的分离与鉴定工作中得到广泛应用.这类方法的主要依据是药物发生代谢转化后,一般仅是在原药的基础上进行部分结构修饰,药物的母体结构一般不会发生太大变化,因此代谢产物与原药常有相似的质谱特征离子,据此可以对代谢产物进行识别,再结合共它衅片特征,对共结构作出合理的判断.实际应用中,常结合同位素标记来辅助代谢物的识别,并将代谢物的EI肥行为与合成品对照,进一步证实其化学结构 色谱—质诺联用方法由于灵敏度高,特异性强,特别适用于体掖中疽量代谢物的检出及质谱行为较相似的系列化合物代谢转化规律的研究工作气相色谱—质谱联用技术(GC刷s)由于商品化仪器出现较早,在药物代谢研究中应用较为广"泛.但气相色谱对样品的极性与热稳定性有一定要求,因此在用GC朋S分析前,样品的预处理颇为重要,药物及其一相,二相代谢产物的热稳定性,挥发性,极性可能差异较大,需要根据具体情况对样品先进行水解处理或衍生化处理 其中硅醚化衍生方法在药物代谢研究中应用最为普遍,有多种硅醚化试剂可供选择,常用的有踢T12A/1%IM畅,胁等.衍生化后的代谢物不但色谱行为改善,而且其质谱行为对代谢物的结构阐明能提供更多证据近年来.各种液相色谱—质谱(比爪仍)接口的研制成功及商品化,使比爪亿成为药物代谢及药物代谢动力学研究的有力工具 与CC肥技术相比,比朋S的样品前处理简单,一般不需要水解或衍生化处理,可直接用于药物及其一相,二相代谢产物的同时分离与鉴定较早的比爪侣接口有传送带(阳),粒子柬(阳),热喷雾(蝇),其中咒化肥较为成熟,灵敏度较高,在药物代谢研究中应用已较夕卜u].新近出现的大气压电高技术.电喷雾(ES)和大气压化学电离(A1吧I)技术,是液相色谱—质谱联用接口方面的一大进步,国外已有商品供应,正在受到药物研究工作者的重视与欢迎,府用日益广汐'卜14J 电喷雾技术作为一种相对"软"的电离技术,特别适合于药物第二相结合物,如葡萄糖醛酸结合物,硫酸酯结合物等的检出.大流量电喷雾技术(me8dHow—ES)与大气压化学电离技术还能与内径2.1删或4.6删的常规HPLL校直接联用 同时在AKl6术中,通过灵活改变锥电压(咖c W1吨e),可以获得与MS肋S中碰撞诱导解离(cH))相比拟的分子诱导碰撞淬片信息,克服丁一般化学电高技术碎片信息少的缺点UZ/Ms肋s,MS/kIb联用技术中恒定中性丢失(4L)与CID技术使药物代谢产物的分离,检测与结构签定的过程变得更为方便和快捷.总之,随着质谱技术以及液质接口技术的不断发展,液相色谱—质谱联用终将成为研究药物代谢及药物代谢动力学十分有利的分析手段。
四,手性药物的分离分析方法
手性是自然界普遍存在的特征 电物体系统内部的受体,酶,核酸,蛋白以及多糖等都具有与其功能相适应的手性结构 药物存在对映体时,在其进入生物体内后,因受这些手性物质的选择性控制,其代谢途径和药理作用常不相同,生物活性和药效也就不同,而其毒副作用也常存在差异.近年来的临床实践多次证明了这一点.即其中一种异构体有治疗作用,而另一对映体则无作用,或甚至有很强的毒性或副作用 据认为现在市场上销售与临床上使用的许多化学合成药物有75%以1:是外消旋体的形式.即为两种光学异构体的等量混合阶"i 为了用药的安全有效,有必要对手性化合物的各个异构体分别进行考察,了解各自的生理活性.不少国家己规定,要求申报手性药物时,必须对不同异构体的生理作用叙述清楚.因此手性药物的分离和测定在药物分析中就占有很重要的地位,以便对药物进行质量控制,并为药物的药理,毒理研究提供分析手段.由于对映体的物理化学性质几乎完全相同,经典的分析方法和一般的色谱方法无能为力 近年来手性分离已成为分析化学中的一个热门课题,也取得了很大的进展.目前最常用的方法是色谱法和毛细管电泳法.分离时可采取两种途径,即直接法和间接法.两种方法都涉及非对映异构体的形成,所不同的是所形成的非对映异构体是否具有可逆性.采用间接法时,将对映体混合物与光学纯的手性试剂反应,生成两个非对映异构体,然后用常规的色谱方法分离 这种方法分离的是衍生产物而不是原对映体.间接法的优点是:(1)可使用价格便宜,柱效较高的非手性柱(如咖);(2)可选用具有各种发色团或较强荧光发射基团的手性试剂.但其不足之处是:(1)对映体必须含有能与手性试剂反应的基团;[2)衍生化反应操作复杂,费时.且容易造成组分的损失;(3)对手性试剂的纯度,储存和反应过程中的稳定性要求较高;(4)两个对映体的衍生化反应速率应当一致;(5)生成的非对映体应当容易分解为原来的对映体.
在直接法中,又分为采用手性固定相和手性流动相添加剂两种操作.手性固定相法是基于样品与键合到载体表而的于性选择刑(又称于性识别剂)间形成暂时的非对映络合物的能量差或稳定性不同而达到手性分离.手性流动相添加刑法则是通过对映体与添加到流动相中的手性物质分子形成—对非对映的络合物,由于非对映络合物的稳定性,
在流动相中溶剂化作用或络合物与固定相的键合等性质的差异而得到分离,与间接法相比,直接法具有很大优势.为气相色谱法,高效液相色语法及超临界流体色语法设计使用的手性固定相己有多种成为商品出售,其应用日益广aL'HN,新的手性固定相和手性选择剂仍不断出现.但手性固定相的价格较高,在一定程度上限制T它的使用.
值得一提的是近来利用毛细管电泳拆分手性化合物的工作日见增岁"ih,尤其是使用环糊精及其衍生物为手性选择刘的报道占主要部分.其它如冠醚,低聚糖,蛋白质,大分子抗生素等也有手性拆分的能力.这方面的研究正方兴来艾.但毛细管电泳的样品处理量太小,无法用于制备工作。
五,展望
上面简单地讨论了分析化学在药物的质量控制,新药研究,药物代谢,手性药物分析等力面的应用,从中可以看出药物分析所起的作用 前面也已经提到,药物分析涉及的面很广,其对象更为多种多样,包括合成药物,生物药品,中草药,毒物,成瘾药物,兴奋剂,临床药物监测,等等.随着生物工程的发展,基因药物会日益增加,肯定会时药物分析方法和质量控制内容提出更多更高的要求,可能会引入更多的新的仪器分析方法,以及生物技术和生化方法.药物分析中所使用的方法现在已是多种多样,随着其它学科的发展,老的方法将不断更新,新的方法将层出不穷.此外,计算机的发展更是迅速,它在分析中的应用必将不断深入,从而带动着分析仪器也将缩短更新换代的时间,并将出现多种智能化,微型化的自动分析仪器.药物分析工作者也必须努力学4新的有关知识,才能跟上科学的发展与进步,做好自己的工作。
