试剂、试剂盒 DAPI乙醇甲酰胺冰乙酸杂交缓冲液甲醇Nonidet P40 SSC

仪器、耗材 盖玻片BCR ABL 双色双融合探针

实验步骤

一、样品

1.用经过培养的并且按照血液恶性肿瘤标准细胞遗传学程序收获的骨髓和外周血可以得到最好的结果。

2.对于HSH研究来说，用新鲜制备的片子很重要。固定在甲醇和冰乙酸中的细胞储存于-7.0°C中，直到 FISH 研究需要时才滴片。

3.外周血和骨髓涂片也可以用这种方法处理。

4.在对每批患者样品研究中应该包括带有正常和异常细胞的pH染色体阳性的对照玻片。

二、标本制备

1.用相差显微镜扫描载玻片，定位一个包括足够数量间期细胞的区域。这些细胞应该形态良好并且重叠细胞应该最少。如果这张载玻片不满意，最好是准备另一张玻片而不是继续以下操作。

2.将新制备的载玻片在65°C的烤箱中烤1h或者在90°C的烤箱中烤10min。不要延长高温（60~90°C)烤片的时间。

3.把这张载玻片放在装有2XSSC溶液的染色缸中，于37°C放置1h。

4.将载玻片依次放入室温下盛有的70%、85% 和100% 的乙醇中各lmin，将载玻片脱水。气干。

三、变性和杂交

染色缸法

1.对于中期分裂相研究来说，将制备好的载玻片在74°C下70% 的甲酰胺中变性Imin; 对于间期相研究来说，变性时间为2 min。

2.将制备好的载玻片依次放入室温下盛有的70%、85% 和100% 的乙醇中各lmin，将玻片脱水。气干。

3.取3juL的LSI?BC尺/ABL探针工作液到0.65 mL的小离心管中，离心10s。

4.将探针混合物漂在74°C的水浴中变性5 min。

5.将离心管从水浴中取出并且马上将探针混合物加到制备好的载玻片上并且把玻片放在45°C的玻片温箱中。

6.将一张圆形12 mm的盖玻片放在杂交区域上。用橡皮泥封住载玻片。将制备好的载玻片放在湿盒中，37°C持续8?20 h。

7.杂交后洗脱。

HYBrite(Vysis，Inc.，DownersGrove，IL.)共变性方法

1.取3uL LSI BCR/ABL 探针工作液直接加到制备好的染色体载玻片上。用圆形12 mm的盖玻片盖住杂交区域。用橡皮泥封住盖玻片。

2.用水填充HYBrite槽。注意不要将槽内的水放得太满，因为这会影响DNA变性过程。

3.设置HYBrite程序如下：融解温度80°C，融解时间5 min，杂交温度37°C，杂交时间20 h。

4.把载玻片放在HYBrite槽中并且让机器执行杂交过程。

5.把载玻片从HYBrite槽中取出，进行随后3.4的杂交后洗脱步骤。

四、杂交后洗脱

1.去掉橡皮泥。仔细拿掉盖玻片并且丢弃。

2.把载玻片放在盛有0.4XSSC的染色缸中，74°C放置2 min。

3.拿出载玻片并且把它放在盛有2XSSC/0.1%NP-40的染色缸中室温洗涤1min。

4.把载玻片从染色缸中，玻片边缘接触纸巾去掉过量的2XSSC/0.1%NP-40。

5.把10ul 的DAPI-I工作液加到杂交区域上。

6.在杂交区域上放一张盖玻片。轻压盖玻片去掉气泡。准备用显微镜分析载玻片。

五、显微镜

1.使用带有100ul汞灯的高质量的荧光显微镜。

2.使用FITC和德克萨斯红双通道设置来同时观察信号。使用FITC或德克萨斯红单通道设置来观察单一荧光。

3.使用带有适当图像分析系统软件的计算机来捕捉需要记录的细胞图像。

六、评分标准

1.Vysis的探针产生一个绿色信号（G)，ABL探针产生一个红色信号(R)，背景染色质为蓝色。观察到的BCR/ABL 融合信号为红色和绿色接触的信号或者是一个黄色信号。本章后边的用F来指代BCR/ABL融合信号。

2.正常的间期或中期细胞有2 红 2 绿信号，没有F 信号（图 2)。

3.带有一个 Ph 染色体的异常细胞核或者有1 红 1 绿2F 信号，或者有2 红 2 绿 IF 信号。带有两个Ph 染色体的细胞核或者有1 红 1 绿3F信号，或者有2红2绿2F信号。

4.带有非典型异常I>FISH 类型的 Ph 染色体阳性的中期或间期细胞将会有 5 个或者更少的信号，至少一个融合信号。非典型信号类型包括 2红 1 绿 IF信号，1 红2绿 IF信号或 1 红 1 绿 IF信号。

5.如果对于一个细胞是杏应该评分或者是否有融合信号有疑问，就不要对这个细胞评分了。

七、标本制备的分析

1.在分析患者样品之前计数 100 个细胞核作为阳性对照来确保这种方法能工作。

2.如果可能，在治疗前分析 10 个或者更多的 Ph 染色体阳性的中期分裂相来建立 Ph 染色体的信号类型。了解用典型评分标准还是非典型评分标准分析间期细胞核很重要。

3.至少捕捉两个有代表性的间期相来描述这些研究。

4.两个观察者应该分别从杂交位置的两三个独立区域中分别计数 250 个邻近的间期细胞核。

5.如果两个观察者的结果区别大于 5%，第三个观察者应该计数 250 个邻近的细胞，或者应该考虑再杂交一次。

6.如果两个观察者的结果是可接受的，那么这些结果应该取均数来计算样品中有 BCR/ABL融合信号细胞的百分数。

7.如果患者有一个典型信号类型的 Ph染色体并且结果在正常范围内（异常细胞核小于 1%)，那么每个观察者应该分析 6000 个细胞核中超过 2750 个细胞核来寻找最小残留病灶。

8.捕捉载玻片上至少一个区域的图像来描述代表最终结果的几个细胞核。

八、结巣解释

1.有经验的观察者应该很少，甚至从来不会在正常样品中观察到假阳性信号类型的细胞核。对于这些观察者，分析 500 个细胞核的正常切割值是小于 1%，对于 6000 个细胞核，切割值小于 0.079%。

2.有经验的观察者在多数未经治疗的 CML 患者中应该检测到多于 90% 的异常间期细胞。

3.带有非典型信号类型的患者假阳性核的频率不同。1红2绿 IF 患者的正常切割值是 1.2%，2红1绿 IF 患者的正常切割值是 1.8%，1红1绿IF 患者的正常切割值是 23.0%。

九、质量控制

1.任何新试剂在用于临床前应该在对照样品上检测。

2.对于每一批患者的样品应该带一个Ph染色体阳性的对照载玻片。

3.每一个样品应该由两个记录员独立地分析，他们彼此的结果相差应在 5% 之内。

4.每个记录员对照样品的总结结果表格应该保存下来并且常规地对技术问题产生的趋势进行评估。

5.应该调查所有失败的检测结果并且描述下来以建立问题库。

6.生成每月的结果报告来评估检测程序。

7.寻找更多质控的信息。