脂肪酸合酶的测定
实验方法原理
酰基 CoA:丙二酰 CoA C-转酰基酶(脱羧、异丁基还原、烯酰还原与硫酯水解)。
乙酰-CoA+n 丙二酰-CoA+2n NADPH+2n H+ → CH3-(CH2-CH2)n-CO-CoA+n CoA+n CO2+2n NADP++n H2O
式中,n=6~8。
实验材料 脂肪酸合酶
试剂、试剂盒 磷酸钾EDTA二硫赤藓糖醇乙酰-CoA丙二酰 CoANADPHBSA
仪器、耗材 分光光度计
实验步骤
实验所需「试剂」具体见「其他」
0.96 ml 实验混合物
0.02 ml 酶样品
25℃ 时,观察 3~4 min 于 340 nm 处吸收值降低
开始反应需加入 0.02 ml 0.007 mol/L 丙二酰-CoA 0.14 mmol/L
25℃ 时,于 340 nm 处吸收值降低,ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。
其他
试剂:
0.1 mol/L 磷酸钾,pH 6.5
0.1 mol/L EDTA(Mr=292.2;292 mg 溶于 10 ml 水中)
0.1 mol/L 二硫赤藓糖醇(DTE,Mr=154.2 或二硫苏糖醇,DTT,Mr=154.2;154 mg 溶于 10 ml 水中)
0.01 mol/L 乙酰-CoA(Li3 盐,Mr=827.4;8.3 mg/ml)
0.007 mol/L 丙二酰 CoA(Mr=877.3,Li4 盐;6.1 mg/ml)
0.01 mol/L NADPH(Mr=833.4,Na4 盐,83 mg 溶于 10 ml 水中)
2.4% BSA(240 mg 溶于 10 ml 水中)