肽适配体的亲和力成熟实验
实验方法原理
实验材料 质粒 DNA酵母株
试剂、试剂盒 Taq 聚合酶10×缓冲液引物 dATPdGTP dCTPdTTPMgCl2 MnCl2完全极限（CM） 缺失成分培养基和平板Xgal 平板
仪器、耗材 PCR 管PCR 纯化柱自动热循环器 30℃ 培养箱
实验步骤
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 制备 PCR 预混合物（共 3.775 ml）：
500 ul 10×Taq 聚合酶缓冲液
5 ul 1 mol/L MgCl2
10 ul 100 mmol/L dATP
10 ul 100 mmol/L dGTP
50 ul 100 mmol/L dCTP
50 ul 100 mmol/L dTTP
125 ul 20 umol/L 引物 1
125 ul 20 umol/L 引物 2
2.9 ml 水
2. 对每一个样品，加入下列试剂到 PCR 管中：
12 ul 水
1 ul 肽适配体表达载体
10 ul Mg2+/Mn2+ 溶液
76 ul PCR 预混合物
1 ul Taq 聚合酶（5 U）
3. 用下列 PCR 反应程序进行扩增反应：
4 个循环：
30 s 95℃ （变性）
1 min 55℃ （复性）
1 min 72℃ （延伸）
4. 移出 13 ul 反应混合液到一新的 PCR 管中，新管中预先吸入：
10 ul Mg2＋/Mn2＋溶液
76 ul PCR 预混合物
1 ul Taq 聚合酶
用同样的 PCR 程序扩增。
5. 重复总共 10 轮的扩增。
6. 用 PCR 纯化柱或琼脂糖凝胶电泳纯化 PCR 产物。
7. 用 Ava II 消化纯化的 PCR 产物，然后按照标准的亚克隆技术将其亚克隆到经 II 酶切过的 PJM-I1中。
8. 用乙酸锂酵母转化法将 pBait 和 pBR1840 转入 EGY48 中。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura 平板上筛选转化株。
9. 用高效乙酸锂方法将 10～50 ug 突变的肽适配体库转化含 pBait 和 pBR1840 的 EGY48。在 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 平板上筛选转化株。
10. 收集转化株，测定平板效率。
11. 接种约 5 个库等价物到 1 ml Gal/Raf/CM-His、 -Ura、-Trp 液体培养基中。于 30℃ 振荡培养 4 h。
12. 室温下，于 3000 g 离心 4 min。弃上清，将酵母沉淀重悬于 1 ml 无菌水中。
13. 将酵母涂布到 15 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp， X-gal 平板上，于 30℃ 培养至克隆出现（约 2 天）。
14. 将蓝色克隆划线接种到一 10 cm Glu/CM-His、-Ura、-Trp 主平板上并于 30℃ 培养 1 天。
15. 将主平板复印到 10 cm Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp、X-gal 平板和 Glu/ CM-His、 -Ura、-Trp、X-gal 平板上。
16. 从依赖半乳糖的蓝色克隆中回收质粒并重新导入，含有 pBait 和 pBR1840 的酵母株 EGY48 中以再次验证表型。
17. 从依赖半乳糖的蓝色克隆中回收质粒并对可变区进行测序。
注意事项
其他
1. 材料
质粒 DNA：肽适配体质粒，pBait，pJM-1， pRB1840（1-LexAop-LacZ 报道质粒）和 pJK103
酵母株：EGY48 Mata ura3 trpl his3 3LexA-operator-leu2
2. 试剂
5 U/ul Taq 聚合酶和 10×缓冲液（Life Technologies）
1 mol/L MgCl2
100 mmol/L dATP
100 mmol/L dGTP
100 mmol/L dCTP
100 mmol/L dTTP
20 umol/L 引物 1： 5'-CCGCCGCCTGAATTCATGAGCGATAAAATTATTCAC-3'
20 umol/L 引物 2： 5'-CGGGGCGATCATTTTGCACGGACC-3'
Mg2+/Mn2+ 溶液：45 mmol/L ，MgCl2 和 5 mmol/L MnCl2
PCR 纯化柱（可选；如 Qiagen）
完全极限（CM） 缺失成分培养基和平板，补加 2％ （m/V） 葡萄糖 （Glu） 或 2％ （m/V） 半乳糖和 1％ im/V） 棉籽糖 （Gal/Raf）：
Glu/CM-His、-Ura （10 cm 平板）
Glu/CM-His、-Ura、-Trp （10 cm 平板）
Gal/Raf/CM-His、-Ura、-Trp （液体培养基）
Xgal 平板
Glu/CM-His， -Ura， -Trp， X-gal （10 cm 平板）
Gal/Raf/CM-His， -Ura， -Trp， X-gal （10 cm 和 15 cm 平板）
3. 耗材
PCR 管
自动热循环器
30℃ 培养箱
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