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同工酶分析

2019.4.04

收集细胞，用 D-PBSA 洗涤，重新制成 5×107个/ml 的细胞悬液，制备细胞抽提物并置于 -70°C 保存。准备凝胶装置，取 1~2 μl的细胞抽提物、标准品及对照点样于琼脂糖凝胶。槽内充满液体，将琼脂糖凝胶置于其中，电泳 25 min，加入酶反应试剂，孵育 5~20 min 后，冲洗凝胶，干燥，检査已完成的凝胶酶区带的显示。

实验方法原理收集细胞，用 D-PBSA 洗涤，重新制成 5×107个/ml 的细胞悬液，制备细胞抽提物并置于 -70°C 保存。准备凝胶装置，取 1~2 μl的细胞抽提物、标准品及对照点样于琼脂糖凝胶。槽内充满液体，将琼脂糖凝胶置于其中，电泳 25 min，加入酶反应试剂，孵育 5~20 min 后，冲洗凝胶，干燥，检査已完成的凝胶酶区带的显示。
实验材料

细胞抽提物酶底物核苷酸磷酸化酶（NP)6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD)苹果酸脱氢酶（MD）乳酸脱氢酶（LD)天冬氨酸氨基转移酶（AST)6-磷酸甘露糖异构酶（MPI)肽酶B(Pep B)

试剂、试剂盒

细胞抽提缓冲液或Triton X-100抽提溶液缓冲液SAB8.6D-PBSA蒸馏水去离子水

仪器、耗材

Authentikit装置和试剂琼脂糖凝胶膜SAB8.6孵育盘衬垫孵育盘染色或洗涤盘温度控制室的槽盖和槽底定时电泳仪安全连接器孵育室或干燥器配有1英寸长磁力棒的磁力搅拌器样品加样器Teflon 头凝胶记录表酶迁移数据表细胞I.D.最终分析表微升注射器微量离心机Eppendorf 管加样器加样器吸头移液管100ml带刻度的量筒记号笔防护手套装吸头的垃圾桶

实验步骤

一、抽提物的制备

1. 按常规方法培养细胞达 2×107 个活细胞。

2. 依照具体细胞系实验推荐的方法收集细胞。

3. 细胞团重悬于 D-PBSA 中，计数活细胞。

4. 细胞悬液以 300 g 离心 5~10 min 沉淀细胞，倾去上清液。

5. 重复步骤 3 和 4 , 总共洗涤细胞 3 次。

6. 向细胞团块中加人 100 μl 抽提液（细胞抽提缓冲液（Innovative Chemistry，Inc） 或 Triton X-100 抽提溶液：1:15（V / V），Triton X-100 溶于生理盐水，包含 6.6×10-4 mol/L EDTA，pH 7.1（4℃保存））。

7. 小心地将细胞悬液吸取至小容量移液管中，上下吹吸直至全部细胞裂解。

8. 将细胞裂解液移至 Eppendorf 管（1.5 ml）中，用移液管上下吹吸数分钟直至细胞膜成云雾状并集结在一起，用微量离心机（microfuge） 以最高速度 （约 9000 g ) 离心细胞裂解液 2 min ，收集上清液，等分为所需体积，-70°C 保存。

二、安装电泳装置

1. 打开孵育箱电源。

2. 每个孵育盘内放一个盘垫。

3. 在每个孵育盘中加人 6.0 ml 去离子水，37°C 保温 20 min。

4. 向电泳槽每个盘室中加入 95 ml SAB 8.6 缓冲液（整个电槽中缓冲液的总体积为 190 ml） 该缓冲液不可重复使用，因为电泳过程中 pH 值会有显著改变。

5. 将装了缓冲液的电泳槽通过安全连接线与电压可调的电源连接，电源接地。

6. 将每个温控电泳室盖表面充满 500 ml 冷水（4~10°C )。电泳盖一定要在垂直放置时装满水，否则水将流失。用冰将水冷却或在冰箱中贮备足够的冷水，每次电泳前要更换冷水。

7. 在每种染色盘中加 500 ml 去离子水或蒸馏水，并用它洗涤孵育盘。这些水不能重复使用。

三、电泳步骤

1. 标记每块待用琼脂糖凝胶。可用 Innovative Chemistry，Inc 的标签或用永久性记号笔在凝胶背面作个记号。

2. 将凝胶放在台面上，塑料突起向下。调整凝胶方向使样品孔离操作者最近。

3. 标记每个样品孔，标明将被检测的样品，（如：标准、对照、未知 1、未知 2 等）每块凝胶可检测 6 个未知样品。

4. 将琼脂糖凝胶从坚硬的塑料支持物上小心地剥离。沿着边缘小心处理凝胶，弃去硬塑料支持物。

5. 向样品孔加入细胞抽提物。用装有 Teflon 头的分液器将 1 μl 细胞抽提物精确地加到每个孔中。每个样品用一个新的头。将分子量标准品点样于泳道 1，对照点样于泳道 2，未知点样于泳道 3~8。为避免损伤琼脂糖，只有细胞抽提液滴可接触样孔，点样器尖不能碰孔。若点样量为 2 μl，在第 1 μl 样品散到琼脂糖内后再点第 2 滴。

6. 将每个已点样的琼脂糖胶插入电泳槽盖上，琼脂糖面向外。将琼脂糖胶的阳极（+ ) 与电泳槽盖的阳极（+ ) 匹配，可能需将琼脂糖凝胶轻微弯曲以便插入电泳槽盖。

7. 在每个电泳槽座上放一个电泳槽盖。内部有磁铁的黑端最靠近电源。打开电源（160V），定时 25 min 。

8. 在电泳结朿前大约 5 min 时，从冰箱中拿出每种底物试剂瓶，使其恢复到室温。

9. 临用前加入 0.5~1 ml 去离子水至每个试剂瓶中，轻轻地旋转小瓶使试剂溶解。

10. 电泳结束时，从电泳槽座上拿开电泳槽盖并将其置于吸水纸上。

四、染色步骤

1. 从电泳槽室中取出琼脂糖胶，抓住凝胶膜边缘，向内轻压便可将其从盖中取出。

2. 将琼脂糖凝胶侧立，置于水平放在平面上的吸水纸上，点样孔朝向操作者。

3. 仔细地用不起毛的吸纸吸去琼脂糖胶两端残余的缓冲液。

4. 沿着琼脂糖凝胶膜底边放置一支 5 ml 的移液管。

5. 沿着移液管的前缘将重新制备的底物均匀倾倒于琼脂糖胶上。

6. 用平滑的动作推动吸管经过琼脂糖表面，一次完成，再向操作者方向拖回吸管，在琼脂糖表面推多次，吸管滚动着离开琼脂糖末端，在此过程中移去多余的物质，注意不要破坏琼脂糖凝胶，此步无需加压。

7. 将边缘整齐的琼脂糖胶放在预热的孵育器盘中，琼脂糖面向上，并把盘置于 37℃ 孵箱内 5~20 min 。

8. 孵育后，用 500 ml 双蒸水或去离子水清洗琼脂糖胶两次，用磁力搅拌棒搅动，每次 15 min，第一个 15 min 后，取出每个凝胶膜，将水弃去，加入 500 ml 新鲜水于器皿中，将凝胶膜浸人水中，并予以遮盖避光，确保凝胶膜完全浸入而不是在漂浮清洗液上。

9. 从水中取回凝胶膜，将其放置于孵箱或烤箱烘干室的烘干架内，烘干 30 min 或直到琼脂糖胶干燥，也可将琼脂糖胶室温干燥过夜。

10. 清洁整理，倒掉电泳槽底缓冲液，并用蒸馏水冲洗，将电泳梢盖中的水倒出，冲洗槽盖内部，并晾干。

11. 结果评价，区带是永久性的，凝胶膜也可保存起来，便于将来参考，如果随时间延长，出现背景染色，说明凝胶清洗不够充分。

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