1. 处死动物后立即切除肌肉。注意夹持肌腱，以减少对肌纤维的损伤。
2. 将肌肉放入 0.2 % Ⅰ型胶原蛋白酶液（W / V，用 DMEM 配制），在 35°C 条件下用摇动水浴箱孵育 60~90 min。较大肌肉需要较长消化时间，一般情况下取自 6~8 周大鼠的趾长伸肌需消化 60 min 。
3. 准备盛肌纤维的 Petri 培养皿，即用马血清浸洗培养皿，以免肌纤维黏附于培养皿底壁上。然后，加入 20 ml DMEM。
4. 消化后将肌肉移入盛有 DMEM 的 Petri 培养皿。
5. 在透照立体解剖显微镜下，用改良 Pasteur 吸管（将 Pasteur 吸管割断，用钻石笔将开口弄大。然后，用火使锯齿状边缘变光滑，以免损伤肌纤维）研磨肌肉，使单肌纤维分散。
用 10 % 马血清（用 DMEM 配制）浸蘸吸管，以免肌纤维黏附吸管。
6. 肌纤维被分散时，肌肉的直径变小。逐渐用口径小的 Pasteur 吸管。
7. 当分离 20~30 条肌纤维时，将肌肉移入另一 Petri 培养皿，继续分离，直至分离得到足够的肌纤维。
8. 较大肌肉需要第二次消化，以分散位于中央处的肌纤维。表浅的肌纤维被分离后，将剩余的肌肉放人胶原蛋白酶液，进一步消化。
9. 将肌纤维放入涂有 Matrigel （1 mg/ml，用 DMEM 配制）的培养皿。
(a)将单肌纤维放于培养皿中央，让其贴于 Matrigel。为了培养纯单肌纤维，只放入未损伤的肌纤维，除去较皱缩部分。这些部分可能有污染的附着细胞，多为微血管段；
(b)慢慢加入接种培养液（DMEM，添加 10% 马血清、0.5% 鸡胚提取液、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素），注意勿移动接种的肌纤维。
10. 将培养皿放入培养箱，在 37°C 和 5 % CO2 条件下培养。
增殖
培养 12~24 h 后，卫星细胞开始从肌纤维迁出。至 3~4 天，每条肌纤维周围有 50~300 个卫星细胞。确切细胞数取决于肌纤维来源的肌肉和小鼠周龄等多种因素 [ Bockhold et al.，1998 ] 。
11. 许多卫星细胞从肌纤维迁出时，用 Pasteur 吸管将肌纤维吸出。应在火焰上将吸管尖部拉细。
12. 继续培养剩余的细胞。
13. 如果需要，可传代培养，用增殖培养液（DMEM，添加 20% FBS、10% 马血清、1% 鸡胚提取液、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）接种细胞。
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