动物病毒毒力测定实验——TCID50 的测定方法
病毒感染能力测定是评估其毒力的常用方法之一，通常采用测定实验动物的半数致死量（50％ lethel dose，LD50）和测定细胞培养物的半数组织（细胞）培养物感染量（50％ tissue culture infectious dose，TCID50）来评估病毒的感染能力（毒力）。用细胞培养物测定病毒的 TCID50 较实验动物的 LD50 简便、经济，且易控制实辁条件，加之细胞系的同质性高，敏感性比较一致，沒：有个体间的遗传差异。所以本实验介绍 TCID50 的测定方法。
| 实验方法原理 | 溶细胞性病毒的毒力与其致细胞病变的能力直接相关，固可用不同含量的病毒液接种敏感的宿主细胞培养物测定毒力。实验中病毒的毒力以其致细胞病变效应（cytopathic effect CPE）的程度确定，即观察病毒致细胞病变的最高和最低量，以半数细胞病变为病毒感染剂量。然而，实验中所能观察到的是不同稀释病毒致细胞病变的定性结果，需要将结果统计处理，用 Reed-Muench 公式计算，才能获得病毒 TCID50 的相对定量（滴度或效价）。 为了便于理解，以一病毒致细胞病变的观察结果，介绍 Reed-Muench 公式的计算方法。 首先获得表 1 的观察结果： 表 1 病毒 CPE 观察结果 从表中可见，该病毒的 TCID50 在 10-3 和 10-4 稀释度之间。 根据 Reed-Muench 公式 TCID50＝高于 50％ CPE 百分率病毒稀释度的对数＋比距×稀释因子的对数（1）式中，比距＝(高于 50％ CPE 百分率-低于 50)/(高于 50％ CPE 百分率-低于 50％CPE 百分率) （2），将表 1 的数值代（2）式中，则比距＝(91.6-50)/(91.6-40) =0.8。再将比距值代入（1）式中，lg10-3+0.8×lg10-1=-3.8，则 lg TCID50=-3.8，即 TCID50=10-3.8。查反对数得 6310，即该病毒 6310 倍稀释液 0.1 ml 等于 1 个 TCID50。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. MDCK 细胞培养 常规复苏液氮冻存的 MDCK 细胞，接种于培养方瓶中，加入 7～10 ml DMEM 培养液，充分混匀，置 37℃ 培养 2～3d，待细胞形成致密单层备用。 2. 细胞悬液制备 MDCK 单层细胞一瓶，弃上清液，加 0.25％ 胰酶 1 ml，消化 2～5 min，待细胞完全脱壁后加入 3 ml DMEM 培养液，充分分散细胞取样显微计数，调整细胞浓度为 2×105～5×105 /ml。胰酶消化时间不宜过长，否则对细抱造成损伤。初学者可将细胞培养瓶置显微镜下观察，细跑变圆脱壁即可。 3. 细胞接种 取 96 孔塑料细胞培养板一块，用加样器分别向每孔加入细胞悬浮液 200 ul。 4. 细胞培养增殖 细胞培养板置 37℃，5％ CO2 的培养箱中培养 24 h，细胞快速生长，形成 70％ 左右的单层可用于病毒接种。 5. 病毒稀释 将病毒液在 5 ml 无菌试管内作连续 10 倍稀释，即用 1 ml 吸管吸取 0.2 ml 病毒液，加到装有 1.8 ml PBS 的第 1 支小试管内（10-1），充分混匀后，更换吸管，吸取 0.2 ml 加入第 2 管中，连续如此操作，继续第 3 支稀释，如此类推，稀释到第 6 管。 病毒液中务必加少量胰酶（2.5 ug/ml），增强病毒的吸附力。 6. 病毒感 染从 CO2 培养箱中取出 96 孔细胞板，弃上清液，用 PBS 洗 2 次，于每孔加入不同稀释度的病毒 100 ul，每稀释度重复 8 孔。对照组以 100 ul PBS 代替病毒液，然后每孔补加新鲜的 DMEM 培养液100 ul，总体积为 200 ul。 7. 观察细胞培养板置 37℃，5％ CO2 培养箱中继续培养。逐日用倒置显微镜观察细胞病变情况，至少观察一周。 展开 |
