处于非均匀电场中的微粒由于极化效应而产生运动,这种现象称之为介电电泳(Dielectrophoresis,DEP)。Maxwell和Wagner分别在1891和1914年研究悬浮液的介电特性时发现,由于介电微粒与悬浮介质的介电性能不同,在外加电场作用下介电微粒会发生界面极化,形成很大的感应偶极矩。1951年Pohl通过在有机介质中施加交流信号,发现了悬浮微粒的介电电泳现象。1978年介电电泳分析技术被引入化学分析和生物研究领域,1980年Zimmerman将介电电泳技术用于细胞电融合的研究,1991年Pethig等开始研究利用交流电场进行细胞操作,将特定细胞从生物液体中分离出来。其后科学家将介电电泳技术和微全分析系统概念结合,并以微机电加工技术(micro-electromechanical   systems,MEMS)为依托,采用半导体器件制造中的蚀刻技术制作介电电泳芯片,在硅片、玻璃片或高分子膜上制作出μm量级的显微电极结构,形成各种形式的交变电场,进行可选择性分离操作、表征和试验。芯片介电电泳技术的提出和发展为介电电泳分离技术的长足发展和广泛应用提供了新的契机。

近年来,芯片介电电泳研究已从最初对生化样品的简单富集操作,扩展到对纳米材料、金属颗粒等物质的富集、分离和操控等[1~3]诸多方面。将介电电泳技术与流体力[4]、电场力[5]、激光镊子[6]等模式结合也成为研究的新方向,而芯片介电电泳分析系统中的微电极结构是决定分析效能的关键因素之一。因此,设计出分离性能更高、结构更合理的微电极一直是人们关注的重点,目前,介电电泳电极构型已由过去传统的平面式电极向三维式电极发展,出现了夹板式电极、笼式电极和绝缘柱式电极等[7,8]多种构型。相比于常规电泳分析生化样品时必须对样品对象进行复杂预处理或前衍生的缺陷,芯片介电电泳技术可依据样品本身介电性质,在不进行预处理的情况下直接对样品进行DEP富集操控,从而最大限度保持了样品的生理活性;同时介电电泳芯片采用MEMS技术加工制作,整个操作过程都易于调控和实现集成化、自动化;芯片DEP过程中大多采用低压高频交流信号源,易于实现与其它分析方法的联用。芯片介电电泳由于具有以上特点使其在生化样品分析方面具有独特优势。

1  介电电泳芯片分析系统

介电电泳芯片分析系统通常由样品进样和DEP驱动单元、样品富集和分离单元以及检测单元3部分构成。样品富集和分离过程在具有微电极或绝缘体结构的介电电泳芯片上实现。样品进样是通过在介电电泳芯片微通道两端施加DEP直流信号或注射微泵驱使溶液流动来完成的。由交流信号激发的介电电泳称为交流式介电电泳(AC-DEP),交流信号连接在芯片微电极上用以激发分析对象极化,实现DEP富集分离样品的目的;直流信号激发的介电电泳称为直流式介电电泳(DC-DEP),直流信号直接加在芯片微管道两端,利用微管道内的绝缘体使管道内的电力线发生扭曲,产生非均匀电场实现样品的DEP富集操控。

DEP芯片的微电极构型是决定样品富集位置的重要因素。常规介电电泳芯片的电极构型包括堡式电极、抛物线式电极、叉指式电极和圆点式阵列电极等。目前,三维式电极结构由于其富集操控手段的灵活性和电极设计和制作形式的多样性,也是目前研究的热点。AC-DEP模式是最初人们研究介电电泳现象时采用的DEP信号驱动模式,进入本世纪后,人们开始探索DC-DEP和可实现样品连续富集分离的流动式分离模式。

介电电泳分析中最普遍的检测手段仍是CCD显微成像或荧光显色CCD显微成像技术,通过显微镜观测分析对象在介电电泳力代写论文下的富集分离情况获取分析信息。除了常规的CCD显微成像检测手段,将电化学检测手段与芯片DEP模式耦合,是现今DEP检测技术的发展趋势[9]。

2  生化样品的芯片介电电泳富集模式

利用芯片介电电泳进行生物样品的富集和分离时,样品可在DEP作用下根据自身物理性质的差异富集在DEP芯片的不同位置。单纯依靠DEP作为分离富集驱动力时,只能实现微粒的静态原位富集和分离,将这种模式称为静态原位富集模式。当介电电泳力与其它分离方法结合时实现的连续动态富集分离过程,称为动态富集分离模式。

2·1  芯片介电电泳静态原位富集模式

DEP静态原位富集模式是介电电泳研究中最早采用的模式,这时样品富集位置主要取决于DEP芯片中微电极构型的变化,不同的微电极结构所对应的正负DEP富集位置不同,样品依据自身介电性质差异受不同类型DEP作用,富集于芯片的不同位置。

Xu等[10]在带有堡式电极的介电电泳芯片上观测到了红细胞的介电电泳现象。Ramadan等[11]在堡式电极结构上实现了白血球(WBS)、小鼠无性细胞(MN9D)和酵母菌的介电电泳富集,并利用电穿孔技术实现了细胞的电溶解(图1),其管道内溶液流速与细胞融膜率成反比。Arnold等[12]制作了一种可以捕获和培育细胞的具有类堡式电极结构的DEP芯片,通过控制交流信号使酵母菌在负介电电泳(nDEP)和重力作用下悬浮在分离通道内,降低交流信号频率,使酵母菌沉降以实现细胞富集,并在片上进行细菌培养,实现了一系列的细菌悬浮、富集和片上培养操作。

     Li等[13]应用平行阵列电极实现了微芯片上死活李斯特菌的原位分离富集,并通过对细菌荧光染色后区分其活性,再进行荧光显微成像检测。Zhou等[14]设计了一种可以产生交流电渗扩增的介电电泳芯片,芯片电极为三维构型,底面采用阵列电极结构,顶面电极为覆盖整个微管道的面电极,在这种装置上实现了胶体微粒/酵母菌、红细胞/酵母菌混合样品体系的原位富集分离,并对这种情况下样品所受的重Fig.  1　Image of enrichment and lysis process steps of WBC[11]

抛物线式电极结构上溶壁微球菌和大肠杆菌混合样品的分离[15]Fig. 2  Separation of M.lysodeikticusand  E.colion the microchip witha quadrupole   electrode[15]力、DEP力和交流电渗力做了理论探讨。Pethig[15]在抛物线式电极上实现了酵母菌的正介电电泳(pDEP)和负介电电泳(nDEP)富集,以及溶壁微球菌和大肠杆菌混合样品的分离,并利用这一装置研究了样品的生理特性。图2为溶壁微球菌和大肠杆菌在该装置上的分离图像。Abidin等[16]制作了一种可产生高梯度电场的DEP分离(HGES)系统,这种DEP分离装置由两个同心圆柱构成,圆柱与交流信号源接通,圆柱中间填充玻璃微珠用以产生高梯度的非均匀电场,以酿酒酵母为样品讨论了这种装置的捕获效率,并讨论了同心电极尺寸和玻璃微珠直径对细菌捕获效率的影响。

Ho等[17]设计了一种同心星状电极结构的DEP芯片,一系列的同心圆电极结构扩增了DEP信号,有效增强了系统的DEP富集效率。利用这一装置富集肝细胞和内皮细胞,并采用荧光染色方式进行后续检测,装置结构图和实验图像如图3所示。

同心星状电极DEP芯片[17]Fig. 3　On-chip heterogeneous-cells patterning   demonstration[17]在DEP分离中,样品除了受DEP力作用外,在电极附近还会受到电渗流作用使样品发生扰动,通常情况下,分析体系中的电极和样品都是μm尺度的,电渗流对DEP作用的负面影响往往可以忽略不计,但当样品微粒小至nm尺度时,这一影响就不容忽视。为了消除电渗流对纳米微粒富集的影响,  Luo等[18]制作了一种电极宽度在nm级的DEP芯片,实现了纳米级聚苯乙烯微粒和牛血清白蛋白(BSA)的DEP富集。

2·2　芯片介电电泳的分离富集模式单纯依靠常规的电极构型产生DEP力对样品进行介电富集和分离时,很难实现样品的连续分离和快速检测。因此,设计出结构合理、利于实现连续测定的电极构型或者将其它分离技术与芯片介电电泳技术结合,实现样品的连续富集分离和操控是近年来芯片介电电泳研究的热点。2·2·1　DEP与流体力偶合分离　程京等[19]采用棋盘式阵列电极(5×5)将DEP力和流体力结合,实现了外周血细胞(Blood细胞)中宫颈癌细胞(HeLa细胞)的连续富集和分离。实验采用Tris-硼酸缓冲液,分离条件为6V、30kHz,缓冲液流速控制在200μL/min,此时HeLa细胞受pDEP作用被富集在电极表面,而Blood细胞受nDEP作用富集在电极之间,之后利用流体力将Blood细胞冲入废液池,而Hela细胞仍富集在电极表面,利用荧光染料对富集在电极表面的HeLa细胞染色后,进行显微成像检测。Doh等[20]设计了一种可实现样品连续富集分离的微流控DEP芯片(图4),细胞混合样品注入具有三电极结构的微管道内,受pDEP作用的样品偏离管道中心向管道两边富集而从出口1流出,受nDEP作用的细胞运动方向不变从出口2流出,由此实现死活酵母菌的连续流动分离。结果表明,细菌分离效图4　连续介电电泳DEP分离过程示意图[20]

Fig. 4　Scheme of hydrodynamic dielectrophoresis   (DEP)process[20]率与溶液流速成反比。Suehiro等[21]将抗体固定到叉指电极式DEP芯片表面,利用pDEP力将混合样品富集到芯片表面,利用抗原和抗体的特异性吸附作用,使靶细胞与固定在芯片表面的抗体结合,再利用液流将非靶细胞冲走,实现了两种特定细胞的流动式介电富集和分离过程。Yang等[22]将该方法用于李斯特菌的介电诱捕免疫富集。Voldman等[23]在传统叉指电极式DEP芯片的基础上,在分离通道顶部采用SU-8制作了一系列无序搅拌凹槽,使溶液形成湍流,增加样品与电极的接触几率,利用pDEP作用将样品富集于电极表面。该设计中搅拌凹槽的引入间接提高DEP富集效率,可以明显提高聚苯乙烯微珠和B.subtilis孢子的富集效果。

Li等[24]设计了一种将进样、馏分和样品收集三个单元集成在一起的芯片。在进样区域,通过液鞘的夹流作用控制样品宽度,馏分单元部分管道底部布有平行电极(电极宽度和间距均为10μm)用以产生非均匀电场,完成细胞样品的分离和筛选,最后,经过分离筛选的细胞样品从两个出液口排出而被收集。他们对该芯片进样区域的微流控过程进行了计算机模拟,并采用酵母菌为模板样本对装置的分离效果进行了验证。Cummings等[25]提出了绝缘式介电电泳(iDEP)的概念。在常规的十字芯片内刻蚀一系列绝缘体柱,将直流电信号施加在芯片微管道两端,通过管道内的绝缘体柱扰动电力线以形成非均匀电场。他们对DC-DEP模式的理论分析和实验研究发现,在此模式下微粒会经历流动式介电电泳(streaming-DEP)和诱捕式介电电泳(trapping-DEP)2种状态;不同绝缘体形状(圆形阵列电极、菱形阵列电极)、绝缘体直径以及绝缘体间夹角变化对通道内电场强度梯度分布也有影响。他们对活性大肠杆菌(E.coli)和失活的E.coli的混合样品进行了连续富集和分离[26];实现了污水[27]中E.coli、革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis   spores)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)的两两富集分离;富集了革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis   spores)、烟草花叶病病毒(TMV)和E.coli单样品[8],其中E.coli的富集效率接近100%。他们的研究引起了分析工作者对DC-DEP分析模式的浓厚兴趣。Kang等[28]设计了另一种结构的DC-DEP芯片,利用分离通道中绝缘的聚苯乙烯链段,使电力线发生扭曲,产生非均匀电场,聚苯乙烯微球在介电电泳力和流体力的共同作用下依据微粒尺寸得到分离(如图5所示)。Barbulovic-Nad等[29]采用油滴作为绝缘体,通过控制油滴的尺寸间接调整DEP力实现了不同尺寸介电微粒的连续分离。

绝缘电极式DEP芯片分离直径为5·7和15·7mm的聚苯乙烯微粒[28]Fig. 5　Separation of 5·7 and 15·7 mm  particles by applied voltages on different electrodes at 500 V voltage   level[28]2·2·2　DEP与激光镊子耦合分离　1998年Morishima等[30]将激光镊子技术与DEP技术结合,芯片采用抛物线式电极结构,通过nDEP使大肠杆菌富集,同时激光镊子将单个样品移动到监测点进行后续分析,实现了细胞样品的单个检测和操控。Arai等[31]在这两种方法耦合的基础上引入流体力,将单个酵母菌样品从分析区域转移出微通道(图6)。介电电泳与激光镊子技术联用,不能实现大量样品的高效快速富集分离操作,但却可以实现单个样品的精确操控,这为临床上获得纯度为100%的生物样品提供图6　细胞操控过程示意图[31]Fig.  6　Transportion trajectory ofthe target cell[31]了可能。

2·2·3　其它耦合模式的分离　Cui等[32]设计了一种行波介电电泳(twDEP)DEP芯片,其具有一系列平行阵列电极,通过在其上施加相差为90°的交流信号可实现样品twDEP驱动,将样品进行pDEP富集于twDEP电极的初始位置,再对样品进行twDEP操控(图7),实现了乳胶微粒和小鼠心肌细胞的电悬浮和连续流动操控。

Taff等[33]给出一种可以设置细胞富集位置的pDEP细胞筛分阵列的芯片设计,采用同心圆式双层阵列电极,通过对阵列电极的定位控制,实现了单个人类血癌细胞的诱捕、操控和释放。Cheung等[34]设计了夹板式和笼式电极结合的介电电泳芯片(图8),在359kHz~20MHz范围内,采用阻抗检测对经过不同处理的红细胞进行分离和阻抗分析,分析速度达到1000个/min。Yasukawa等[35]提出一种能够用于免疫分析的介电电泳芯片。该芯片采用三维电极结构,能够在芯片微管道内形成介电笼,将作为固相载体的聚苯乙烯固定在芯片管道中,实现了流动体系中抗原与抗体的完全反应,此系统能够在40min内完成对小鼠IgG的免疫分析。