一种针对细胞表面受体进行抗体筛选的多重分析方法 二

实验方法

细胞系和细胞培养

该文章对表达EGFR受体的的A549和A431两种细胞进行了比较，A549，A431和Jurkat细胞购自Sigma。三种细胞的培养条件如下，A549细胞：含有10%FBS的DMEM，2mM L-glutamine和100U/ml青霉素，100U/ml链霉素；A431细胞：含有10%FBS的EBSS（Sigma），2mM glutamine，1×Non-essential Amino Acids(NEAA)(Sigma), 100U/ml青霉素，100U/ml链霉素；Jurkat细胞：RMPI-1640（Sigma），10%FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。A431和A549细胞培养到80%的密度时，利用0.25%胰酶和EDTA进行消化，洗涤，重悬到新的培养基中。未有标注的培养试剂均来自于Life Technologies。

抗体和试剂

鼠抗人EGFR抗体购自Merck Chemical公司（#GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor 647检测标志物（#A21235）来自于Life Technolgy。

CSFE和BiO标记

将5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester CFSE（sigma）溶解到DMSO中，使得CSFE浓度为100mM。将10nM CSFE加入细胞中，在室温条件下孵育10分钟，接着加入4%PBS（2ml）终止孵育，在37℃孵育10分钟。将细胞进行洗涤，在1000×g转速下离心5分钟。对于细胞计数分析，30nM的DiO（Life Technology）加入分析的混合物中，进行孵育过夜。将细胞进行标记后，在488nm的激光下激发，在FL-1通道中检测细胞的荧光信号。

EGFR实验设计   

将抗EGFR抗体在细胞培养液中进行梯度稀释，将稀释后的不同浓度抗体20ul加入384孔微孔板中（Costar 3712）。制备含有1.25×105 细胞/毫升的悬浮细胞（A431或者A549）和6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647标记物的混合物。将20ul细胞混悬液分别加入含有抗体的微孔板中，然后将微孔板在37℃孵育过夜。在mirrorball对微孔板进行检测从而确定结合到细胞上的抗EGFR的量。

细胞多重分析实验   

将20ul稀释后的不同浓度的抗EGFR抗体加入384微孔板中。制备含有相同细胞数的EGFR+A549和CSFE标记的EGFR- Jurkat细胞混悬液（总细胞1.25×105 细胞/毫升，6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647标记物）。该实验是将20ul的细胞混悬液加入含有20ul的抗EGFR抗体的微孔板中（反应孔中的细胞数为2.5×103 细胞和3nM检测标记物）。将微孔板在37℃中孵育过夜后， 放入mirrorball中利用488nm和640nm激光同时扫描检测CSFE染料和结合的抗体的荧光强度。

mirrorball数据收集和扫描样品利用mirrorball上的488nm和640nm的激光进行扫描。每个孔的物体可以利用TTP LabtechZL的阈值运算进行在位分析，同时可以提供形态和荧光参数。数据可以mirrorball特有的Cellista 软件通过多种方式进行显示，包括柱状图，散点图，3D荧光强度分布图，整个孔的图片。

结果

EGFR的Mix-and-read 分析的检测灵敏度

在该研究中，为了在细胞水平结合实验中评估检测的灵敏度，A431和A549细胞，不同浓度的EGFR抗体和Alexa Fluor 647标记的山羊抗鼠IgG共同孵育过夜。图1表明在A431细胞上EGFR抗体的检测浓度为5ng/ml，而在A549细胞上其检测限为5-10ng/ml。这表明EGFR在A549细胞上的表达水平比A431细胞表达水平低。   

该结果表明利用mirrorball检测抗EGFR抗体的水平和已经退出市场的FMAT的检测结果是一致的。两种检测方法在抗体浓度高于100ng/ml 时均出现总荧光强度降低的现象，该现象的产生是由于文献所说的“钩子效应”。由于一抗的过量存在，从而使得结合在检测抗体的荧光无法读取。

图1. A431/A549上的总荧光强度随抗EGFR抗体浓度增加而加强。