单克隆抗体制备中两次筛选的方法及原理
第一次筛选的原理与方法 细胞融合后 杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键 普遍采用的HAT选择培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H） 氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）其依据是细胞中的DNA合成有两条途径是生物合成途径（D途径）即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸 为DNA分子的合成提供原料 在此合成过程中 叶酸作为重要的辅酶参与这一过程 而HAT培养液中氨基酸喋呤是一种叶酸的拮抗物 可以阻断DNA合成的D途径 另一条途径是应急途径或补救途径（S途径）它是利用次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸 两种酶缺一不可 因此 在HAT培养液中 未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的 D途径 被氨基嘌呤阻断 虽 S途径 正常 但因缺乏在体外培养液中增殖的能力 一般10d左右会死亡 对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言 由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤一嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞 因此自身没有 S途径 且 D途径 又被氨基喋呤阻断 所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡 惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞 即具有效应B细胞的 S途径 又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性 因此能在HAT培养液中选择性存活下来 并不断增殖
第二次筛选的原理和方法在实际免疫过程中 由于采用连续注射抗原的方法 且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞的特异性是不同的 经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异 所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原决定簇的特异性杂交瘤细胞 通常采用有限稀释克隆细胞的方法 将杂交瘤细胞多倍稀释 接种在多孔的细胞培养板上 使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时 才能保证有些孔中是单个细胞）再由这些单细胞克隆生长 最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养 因此 单克隆抗体制备过程中 两次筛选的原理和方法是不相同的
原理
B淋巴细胞在抗原的刺激下 能够分化 增殖形成具有针对这种抗原分泌特异抗体的能力 B细胞的这种能力和量是有限的 不可能持续分化增殖下去 因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的 将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞 再进一步克隆化 这种克隆化的杂交瘤细胞是即具有瘤的无限生长的能力 又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力 将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价 单一的特异性抗体 这种技术即称为单克隆抗体技术
