四环素控制系统诱导基因表达实验
pTet-tTAK 稳定转染（第一轮）
pTet-tTAK 稳定转染（第二轮）
| 实验方法原理 |
tTA 是一种融合蛋白，它是由来自于大肠杆菌的四环素抑制蛋白和疱疹病毒的 VP16 蛋白的转录激活区域组成的。在缺乏四环素时，tTA 就结合到并激活位于基因前端的由 Tn10 和一个小的 CMV 启动子组成的七聚体结构的四环素抗性控制子（简称 Tet P）。 当 tTA 结合到 Tet P 后，有四环素存在时，后续的基因就会失活。质粒 pTet-Splice 含有 Tet P 上游、SV40 剪切序列、多聚 A 信号下游及一个多克隆位点，在此编码所选择的目的基因可读框的序列可以很容易地插入。自主调控的 tTA 的表达是由质粒 pTet-tTAK 启动的，这个质粒中的 tTA 可读框（含有优化的翻译起始序列，Kozak 序列）已插入到质粒 pTet-Splice。 这个方法介绍用 pTet-tTAK 稳定转染贴壁细胞，以产生表达可诱导 tTA 的细胞系。 第一轮转染后，可产生仅仅表达可诱导 tTA 的稳定细胞系。也可以用此方案进行 pTet-tTAK 和表达靶基因的质粒稳定共转染。第二轮转染是用表达靶基因的质粒转染表达可诱导 tTA 的稳定细胞系。 |
|---|---|
| 实验材料 | NIH3T3 细胞 质粒 |
| 试剂、试剂盒 | 完全的 DMEM-10 培养基 完全的 DMEM／tet 选择培养基 CaCl2 HEPES 缓冲盐（HeBS） 氯喹 甘油 嘌呤霉素 PBS 1 × 胰酶／EDTA |
| 仪器、耗材 | 10 cm 和 6 cm 组织培养皿 4 ml 聚苯乙烯管 24 孔和 6 孔组织培养皿 |
| 实验步骤 |
实验前准备详见「其他」。 1. 用完全 DMEM-10 培养基培养细胞。转染前一天，用完全 DMEM/tet 培养基接种适量的细胞于 10 cm 组织培养皿中，使在转染时细胞生长至 1/3 汇片。 此后，细胞的培养都要含 0.5 μg/ml tet。 每次转染需要一个培养皿。一个典型的实验应该包括 tTA 对照培养皿、tTA 和靶基因对照培养皿，以及非转染对照培养皿。 2. 转染之前使质粒线性化，调节质粒浓度>0.5 mg/ml。 3. 用 500 μl HeBS 在干净的 4 ml 聚苯乙烯管混合 10~20 μg 的 pTet- tTAK (带或不带等摩尔数的目的基因质粒）和 1~2 μg pSV2-His (每一 tet 质粒与 带选择标记质粒的摩尔数比例为 10:1）。 设立无 DNA 的转染对照。在含 125 μmol/L L-组氨醇的选择培养基中（步骤 14），所有无 DNA 转染的细胞都应死亡。 4. 向质粒 DNA 中加入 32.5 μl 2 mol/L 的 CaCl2，立即轻轻振荡混匀。间歇轻轻振荡，在室温放置 15~30 min 让沉淀生成，或直至与装水的管相比有明显混浊。 5. 将培养基从细胞中吸出，一次做一个板子。用巴斯德枪头抽吸几次混匀沉淀，逐滴均匀地覆盖所有细胞。 6. 温育 30 min，15 min 后轻轻振摇平板，以确保均匀覆盖整个板子。 7. 仅对第一轮：每一平板加 10 ml 含或不含 25 μmol/L 氯喹（终浓度）的完全 DMEM/tet 培养基。 尽管氯喹在用甘油休克处理时会进一步减少细胞的完整性（步骤 9），但它能增加转染的效率。 8. 温育 4~5 h。 9. 轻轻地将培养基吸出，尽量不要触及位于细胞上的沉淀。逐滴加入 2.5 ml 预热的 85% HeBS/15% 甘油，休克处理细胞。 在甘油休克处理细胞前，特别是休克处理后看到细胞碎片是正常的现象。根据研究者操作的速度，可以同时休克处理 2~4 块板子。 10. 2.5 min 后将 HeBS/甘油吸出。快速操作，因为甘油对细胞的毒性很大。 根据不同的细胞类型，细胞暴露在甘油溶液中的时间长短是可以调节的，可以延长到 4~5 min 以得到最佳的转染效率。在导致最少细胞死亡的情况下应休克处理更长的时间。 11. 轻轻地、快速地清洗细胞 2 次，每次加入 10 ml 完全的 DMEM/tet， 然后立即吸出。 由于在加入甘油之后，培养皿中的细胞易脱落，将所有的培养基加到培养皿中的一个点上。 12. 加入 10 ml 的 DMEM/tet 完全培养基，温育过夜。 13. 转染后的第 2 天早上，吸出培养基，加入 10 ml DMEM/tet 完全培养基，继续温育。 14. 转染后 48 h，用含 125 μmol/L L-组氨醇的选择培养基将细胞在 10 cm 培养板稀释，在每个 10 cm 培养板上接种 3×104~1×106 细胞。多制备几块中间浓度的细胞培养板，也就是说，接种细胞浓度相当于生长接近汇片的培养板的 1 : 16~1 : 32。 15. 4 天后用含 125 μmol/L L-组氨醇的选择培养基培养细胞。当克隆形成后，将选择培养基中 L-组氨醇的浓度增加至 250 μmol/L。 L-组氨醇对于细胞是有毒性的。选择培养基中 L-组氨醇的浓度开始应保持在较低的水平，当大量的细胞高水平表达 PSV2-His 时再增加 L-组氨醇的浓度。 16. 当克隆形成完好（选择 12~14 天），环绕克隆四周做个标记。从培养皿中吸出培养基，将一个塑料克隆环环绕单独克隆放置。用 100 μl PBS 快速冲洗克隆，加 2 滴胰酶（100 μl） 处理 30 s~1 min。 从培养皿中挑选细胞，单独的克隆适度地分布于培养皿上很容易区分。 17. 用一个巴斯德吸管上下吹打将细胞吹散，并把克隆转移到含 1 ml 250 μmol/L L-组氨醇选择培养基的 24 孔板孔中。 18. 当细胞长满时，用 500μmol/L L-组氨醇选择培养基将细胞转移至 6 cm 的组织培养板中。 所有的胰酶消化均按照标准的方法进行，包括快速的 PBS 清洗，1~3 min 的胰酶/ EDTA 温育（每个生长至汇片的 10 cm 的培养板用 2 ml） 和用含 10% 牛血清的 500 μmol/L L-组 氨醇选择培养基稀释终止胰酶消化反应。 19. 将待检测的细胞用 500 μmol/L L-组氨醇选择培养基扩增。将要保存的细胞分装并冻存于液氮中。此后细胞用 500 μmol/L L-组氨醇选择培养基进行培养。检测 tTA 或目的基因的表达或者进行第二轮转染，见「pTet-tTAK 稳定转染（第二轮）」。
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| 注意事项 |
1. 所有的组织培养都在加湿的 5% CO2 培养箱中 37℃ 培养。 2. 每次转染需要一个培养皿。一个典型的实验应该包括 tTA 对照培养皿、tTA 和靶基因对照培养皿，以及非转染对照培养皿。
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| 其他 |
完全的 DMEM/tet： 完全的 DMEM-10 培养基包括 0.5 μg/ml 盐酸四环素（Sigma；在 70% 的乙醇中稀释 10 mg/ml 储备，避光在 -20℃ 条件下保存） 选择培养基含 125 μmol/L、250 μmol/L 或 500 μmol/L L-组氨醇 第一轮或共转染所需的质粒： pTet-tTAK (Life Technology) 和含 IE 基因可读框的质粒，靶基因克隆到 pTet-Splice (Life Technology)， PSV2-His 或其他有选择标记的质粒；经过 CsCl 或阴离子交换层析法纯化。 第二轮转染所需的质粒： 含靶基因可读框的质粒，靶基因克隆到 pTet-Splice (Life Technology)、pPGKPuro 或其他有选择标记的质粒；经过 CsCl 或阴离子交换层析法纯化 2mol/L CaCl2 10 mg/ml 氯喹（19 mmol/L，选用，Sigma）; 用水稀释，在-20℃ 保存 85% HeBS/15% 甘油 37℃ 预保温 3 mg/ml 嘌呤霉素（Sigma） 用 PBS 稀释
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