一文读懂蛋白质转印原理大分子量蛋白转印有哪些技巧

2019.12.18

　　通过凝胶电泳分离蛋白后，蛋白质被转移到固体膜载体上进行后续步骤。有效的转印依赖于膜的选择、所使用的转印设备的类型以及转印缓冲液的组成。

　　转印条件

　　蛋白的有效转印依赖于蛋白质从凝胶中迁移出来，也依赖于蛋白在膜上的滞留。像凝胶电泳一样，转印步骤将带负电荷的蛋白转印到带正电荷的电极上。转印效率受所用转印设备的类型、蛋白类型、转印缓冲液和转印条件的影响。

　　湿转和半干转

　　Western blotting常用两种传输设置：湿转(图1.3和表1.4)和半干转(图1.4和表1.5)。

　　湿转-在湿转装置中，一个“三明治结构”被组装起来，由凝胶和膜组成，膜的两侧放几层滤纸。滤纸-凝胶-膜-滤纸夹芯的，每一面都有海绵状的纤维垫，组装完成后，将其放入充满转印缓冲液的转印槽中，电流通过缓冲液将蛋白从凝胶转印到凝胶中。

　　通过改变缓冲系统(见下一节)、转印时间和转印电压，可以优化蛋白从凝胶到膜的转印。

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　　湿转方法用于大多数印迹应用，并提供高度一致的结果。该方法特别适用于转印分子量范围广的蛋白，由于其一致性，定量分析时推荐湿转。

　　湿转的缺点之一是每次转印需要大量的缓冲液。另一个缺点是热量的产生，特别是在较长的转印过程中。过多的热量会导致凝胶间不一致的转移，蛋白变性，甚至凝胶的破坏。因此，强烈建议使用冰袋、冷却循环器，保持转印设备的冷却。

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　　半干法转印-半干法转印装置使用与湿法转印类似的堆叠，但是“三明治”结构放置在两个电极板之间，而不是浸入充满缓冲液的装置中(图1.4)。因此，该方法避免了湿转系统所需的大量缓冲液(表1.5)。

　　半干式转印装置的最大优点是转印速度快。由于电极之间的距离被减到最小，产生了一个强电场，从而可快速转印。该方法的另一个优点是，凝胶两边使用不同的缓冲液——一边促进蛋白从凝胶转移到膜上，另一边促进蛋白在膜上停留。

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　　然而，强电场也是这种方法的一个缺点。低分子量的蛋白可能会转过，此外较大分子量蛋白所需的转印时间较长，但是缓冲液的量有限。

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　　转印缓冲液

　　转印缓冲液含有多种促进蛋白转印的成分(表1.6)。缓冲液的优化是基于所使用的转印系统类型(湿转或半干转)、使用的凝胶类型、膜的选择和感兴趣的蛋白。

　　缓冲液特性——转印缓冲液必须具有强大的缓冲能力，以在转印过程中保持传导率和pH值的稳定。缓冲液的pH值必须与相关蛋白的等电点(pI)不同，否则蛋白不会发生转移。

　　最常见的缓冲液是pH值为8.1-8.5的Tris，高于大多数蛋白的pI。当转印高分子量或碱性蛋白时，也可以使用较高的pH缓冲液，如CAPS或碳酸盐。

　　电压和时间

　　每次转印应优化时间和电压。虽然蛋白在高电压下转移更快，但转移效率并不总是一致的。不足的电流或时间可能导致不完全转印，而高电流或较长的转移时间可能导致蛋白透过膜。转移条件指南通常与转移设备一起提供。然而，这些条件可以根据感兴趣的蛋白进行调整。一般来说，较长的转印时间和较低的电流，用于湿转，而较短的转印时间与高电流用于半干转。

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　　我们将给5点建议，帮助胶上大分子量蛋白的转印。

　　牺牲胶的韧性来提高效率

　　低浓度的丙烯酰胺凝胶可能难以操作。一旦手指触摸它就会撕裂？但是，与高浓度的凝胶相比，大蛋白将更有效地从较低浓度的凝胶中移出（分辨率更好）。因此，提高你的灵活性和耐心，尝试6-7.5％的凝胶。或者可以尝试使用梯度凝胶，可以同时分辨小分子量和大分子量蛋白质。

　　去除去垢剂

　　较大的蛋白质可能在凝胶中沉淀，抑制转印。在SDS-PAGE期间添加的SDS通常会解决这个问题，但较大的蛋白质可能需要更多的SDS。您可以在转印缓冲液中添加最多0.1％的SDS以阻止沉淀的产生。因为SDS抑制蛋白质与膜的结合，因此请尝试从低浓度的SDS开始（例如0.0375％），然后逐步提高。

　　如果确实在转印缓冲液中添加了SDS，则需要重新优化其他转印条件，如转印时间和电流，以防止蛋白透过膜。

　　降低甲醇浓度

　　甲醇与SDS具有相反的作用。虽然甲醇增加蛋白与膜的结合，但它从蛋白质中剥离SDS。因此，降低转印缓冲液中的甲醇浓度也有助于防止蛋白沉淀。您可以将浓度降低到10％或更低。如果您使用的是PVDF膜，则可以完全省去甲醇。在使用之前，不要忘记用甲醇将膜激活！

　　甲醇也会导致凝胶收缩，所以如果减少甲醇，你的凝胶会膨胀得更多。这也有助于转移大分子量蛋白。但您可能需要使用比正常情况稍大的滤纸和膜。

　　慢速转印大分子量蛋白

　　大分子量蛋白想要获得良好的转移效率可能需要更多时间。快速移动那些大分子可能很困难。尝试以较低的电压过夜转印。只是不要忘记保持转印要在低温环境！