多激光扫描

mirrorball的三激光使得用户可以利用多种荧光标记的标志物进行细胞计数分析。在该研究中，A549细胞被DiO标记（488nm激光激发），同时利用EGFR抗体和AlexaFluor 647标记物进行多重分析。经过过夜的孵育，利用488nm和640nm双重激光进行细胞数和EGFR标记分析。图2表明在细胞数目恒定的情况下，，细胞的总荧光强度随着EGFR抗体浓度的增加而加强。非常重要的一个特征，细胞数目可以在没有EGFR抗体结合的情况下得到。

图2：A549细胞总荧光强度随着EGFR浓度增加而加强，细胞计数可单独读取。

细胞的多重分析

mirrorball所独有的多种激光同时扫描特征可以在转染和宿主混合细胞中区分出抗原表达和未表达的细胞群体。为了阐明该方面的特性，在A549（EGFR+）和CSFE标记的Jurkat （EGFR-）进行EGFR抗体的结合筛选实验。在分析之前，将Jurkat细胞进行CSFE（10nM）的染色。图3显示了A549和Jurkat细胞在100ng/ml抗体的结合条件下的3D荧光强度图谱，可以看到EGFR抗体特异性结合到A549细胞，在Jurkat细胞未检测EGFR抗体的结合。

图3： 细胞计数的三维分析。在混合细胞中，mirrorball利用多重激光扫描，可以同时检测A549和Jurkat细胞的荧光信号。

图4显示利用A549单一细胞和A549，Jurkat混合细胞进行EGFR抗体结合实验，其检测灵敏度的没有明显的差异。

图4：利用单一A549细胞和Jurkat，A549细胞进行EGFR结合实验的比较。利用单一细胞群体和混合细胞对结合实验没有明显的差异。

讨论

TTP Labtech公司的mirrorball微孔板计数仪为细胞表面抗原抗体的筛选试验提供一种稳健，即混即读的方法。该仪器非常适合抗体的研发，其独有的光学元件和软件设计使得该仪器具有极高检测灵敏度，足够检测低丰度的蛋白的结合实验。

该文章表明EGFR实验设计非常简单，经过简单的修改即可在mirrorball上进行分析。这种“Mix-and-read”分析方法与传统的ELISA步骤比较可以免去洗涤，孵育步骤，从而大大节省筛选所需要的时间。 同时，该实验采用较少的样品和试剂消耗使得实验的花费大大节省。

mirrorball是提供多激光同时扫描的第一代分析系统，可以对荧光进行激光之间的矫正。与合适的荧光试剂结合使用，这种多激光的同时扫描的能力可以进行独立的细胞识别和多参数分析，提供筛选的通量，大大降低实验的成本，使得实验操作非常的便利。在该文章中，采用DiO的反染，细胞数目可以不依赖于抗体的结合而直接进行测定，这样可以排除由于细胞接种的不同或者细胞毒性引起的假阳性。

另外，mirrorball拥有在同一个孔中能够区分出宿主细胞和转染了特定基因细胞的能力，该能力可以极大的加速抗体筛选的进程。mirrorball还拥有在同一孔对A431和Jurkat细胞进行同时检测的能力。 细胞的多重分析拥有很多优势，譬如可以排除不同细胞之间的板间差异，筛选通量增加一倍，减少样品的使用量。

参考文献
1. Lee, R., Tran, M., Nocerini, M. and Liang, M. (2008) A High-Throughput Hybridoma Selcetion Methods Using Fluorometric Microvolume Assay technology. J. Biomol. Screening 13: pp210-17.
2. Bowen, W. and Wiley, P. (2006) Application of Laser-Scanning Fluorescence Microplate Cytometry in High Content Screening. Assay and Drug Development Technologies. 4: pp209-2

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