采用ACQUITY UPLC H-Class系统的多元溶剂混合能力开发肽谱图分析方法

目标

ACQUITY UPLC ® H- Class 系统采用四元溶剂混合的自动化优化方案，对肽谱分析条件进行系统性优化。

背景

肽谱分析用于确认某种蛋白质的一级结构，识别翻译后修饰（PTM），并分析杂质。任何蛋白质结构差异反映在含有该修饰的肽保留时间的变化中。

某种蛋白质的完整结构定性，需要能够分辨 100 或者 100 个以上的多肽分辨率，这些多肽的分子大小和分子特性跨度范围很大。当开发分离这些肽段的分离条件时，包括改变流动相组成和有机溶剂组成的变化。而且每项测定条件要求制备一对混合溶剂，该溶剂涉及两项或者三项准确的量度。

采用 ACQUITY UPLC H- Class 系统进行四元溶剂的混合，混合溶剂的产生是由系统从纯溶剂瓶中抽出混合而成。此方式减少了制备许多溶剂混合物的工作量，而且使得出错的可能性最小化。同时能够简易地测定中间组分。

ACQUITY UPLC H- Class 系统简化了可用于定性蛋白质的结构的肽图谱分析方法的开发和优化。

ACQUITY UPLC H-Class 系统以及它的四元溶剂混合能力旨在帮助客户关注分析的质量 , 高效地获取可靠的结果。

溶液

采用 ACQUITY UPLC BEH 300 C 18 色谱柱和多重流动相溶剂分离 MassPREP TM 烯醇酶的胰蛋白酶酶解肽段标准品。在 ACQUITY UPLC H-Class 系统中，我们设置水为 A 路溶剂，乙腈为 B 路溶剂，异丙醇为 C 路溶剂， 1% 的 TFA 水溶液作为 D 路溶剂。为了评估酸浓度的效果，三种相同梯度的乙腈升高洗脱梯度分别在 2.5% ， 5% 和 10% 的 D 条件下运行，象对应的 TFA 的浓度分别为 0.025% ， 0.05% ，以及 0.1% 。

烯醇酶多肽消化标准

柱：多肽分离技术 BEH 300 C 18 ， 2.1X 100mm ， 1.7 μm

溶剂： A: 水， B: 乙腈， C ：异丙醇， D:1% TFA

图 1. 溶剂组成可使用 ACQUITY UPLC H- Class 系统的 Aut o · Blend TM 功能简易地进行调节。在本例中，肽图谱的 TFA 最佳浓度仅仅通过改变从 D 线取得的流量百分比的变化而确定的。没有必要制备更多瓶的溶剂，而且可花费最少的劳动测定中间值。

图 2. 使用 ACQUITY UPLC H- Class 系统的自动混合功能从纯溶剂瓶中提取纯溶剂混合成溶剂混合物。

图 1 中的色谱层析结果显示了随着酸浓度的变化，色谱选择性的显著变化。该实验可以通过重复相同的实验但使用递增的异丙醇梯度进行拓展，其能够通过运行溶剂 A （水）到溶剂 C （异丙醇）的梯度方便地实施，而溶剂 D 的浓度保持恒定，与先前实验中的浓度一致。溶剂从乙腈变为异丙醇缩短了留柱时间 , 同时也显著改变了选择性。

该系统实验评价了六种不同的流动相配方以确认最佳的肽图谱。选择性的改变可用于获得混合物中的关键多肽的最佳分辨率。如果使用二元体系或者使用开关阀进行这些实验，科学家们需要制备 12 瓶流动相溶液，至少需要 24 项体积量度。当采用 ACQUITY UPLC H- Class 系统时，仅使用了一种混合物，使用与三瓶纯溶剂相联系的两种度量体积（图 2 ）。 ACQUITY UPLC H- Class 系统可减少工作量，工作的时间，以及错误存在的可能性，以达到优化的分离条件。

总结

生物化学家能够采用 ACQUITY UPLC H- Class 系统有效地开发用于定性蛋白质的肽图谱分析方法。该系统使用便捷的四溶剂混合能力辅助用户关注于分析的质量，使其能够有效地开发完备的 , 可靠的分离方法。 ACQUITY UPLC H- Class 系统结合了 UPLC 分离原理和灵活的设备操作，以获取最佳的生物分离结果。