叶绿体色素的定量测定
【原理】
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的光密度D与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即：
D=kCL
式中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的光密度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总光密度等于各组分在相应波长下光密度的总和，这就是光密度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的光密度D，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式：
D663 = 82.04Ca+9.27Cb （1）
D645 = 16.75Ca+45.60Cb （2）
式（1）、（2）中的D663和D645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的光密度，Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度，以mg/L为单位。解方程组（1）、（2），得：
Ca = 12.72D663 – 2.59D645 （3）
Cb = 22.88D645 – 4.67D663 （4）
将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）：
CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663 （5）
另外，由于叶绿素a、b在652nm的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次光密度（D652）而求出叶绿素a、b总量：
CT =（D652 × 1000）/ 34.5 （6）
在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。
Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正，提出了80%丙酮提取液中三种色素含量的计算公式：
Ca = 12.21D663 – 2.81D646 （7）
Cb = 20.13D646 – 5.03D663 （8）
Cx·c=（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/ 229 （9）
式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx·c为类胡萝卜素的总浓度；D663、D646和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的光密度。
