题目：CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables

　　Reprogramming to Pluripotency

　　期刊：Cell stem cell

　　影响因子：23.394

　　主要技术：CRISPR-dCas9-VP64激活系统、诱导性多能干细胞构建、原代细胞制作、iPS鉴定

　　研究背景

　　 终末分化的成体细胞逆分化，形成多能干细胞状态的过程称为细胞重编程（Cell reprogramming）。在2006年，日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）发表诱导性多能干细胞（iPS, induced pluripotent stem cells）构建技术，利用逆转录病毒，把OSKM（OCT4, SOX2,KLF4 and C-myc）四因子在体细胞中进行超表达，成功把小鼠胚胎成纤维细胞诱导形成多能干细胞，开辟了一个全新的干细胞研究领域。随着研究的深入，人皮肤成纤维细胞、T淋巴细胞等也被成功诱导成多能干细胞。而这些多能干细胞与供体DNA是保持一致的，且有分化成多种细胞的潜力，展现出非常广阔的临床应用前景。如把人血液中的T淋巴细胞逆分化形成多能干细胞后，当定向分化技术成熟时， iPS能被有序分化成需要的细胞，比如心肌细胞、神经细胞等。

　　 染色体上重要的基因启动子位点的表观遗传学变化，如DNA甲基化水平变化、组蛋白乙酰化水平变化、染色质重塑等，开启重要基因如OCT4, SOX2等的内源性表达，是iPS诱导过程中至关重要的事件，直接关系到诱导是否成功。

　　 CRISPR-Cas9系统作为一种强大的基因编辑工具，现今已广泛用于常规的细胞或者个体的基因敲除、基因敲入、点突变外。当CAS9蛋白进行失活改造以及结构域添加后，得到CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统，则能实现特异基因转录激活。CRISPR-dCas9内源基因激活技术（SunTag Gene Activation），正好与iPS诱导技术完美契合，解决了激活内源OSKM四基因的问题，从而诞生了新型的iPS构建策略（见图1）。

　　图1. 利用CRIPR-dCas9基因激活系统的iPS诱导策略

　　研究内容及结果

　　1. 设计定位于Sox2和Oct4基因启动子区和Oct4增强子区的sgRNA，利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64对Sox2和Oct4进行激活。

　　 本研究首先设计了相应基因靶标的SgRNA，启动子区或者增强子区靶标位置考虑因素包括：sgRNA靶标位置与重要的转录因子（OCT4、SOX2、NANOG）结合位点、组蛋白乙酰转移酶p300结合位点的距离，靶标区附近组蛋白乙酰化分布、DNA甲基化分布等。并以MEF细胞为材料，在RNA水平检测了不同sgRNA对靶标基因sox2和oct4的激活效果（图2）。

　　图 2. MEF细胞中，Sox2和Oct4基因启动子区和Oct4增强子区不同sgRNA的转录激活效果验证实验

　　2. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统对重要基因进行内源激活，能成功获得iPS。

　　 随后，同样使用此方法，利用筛选出来18个有效sgRNA，分别激活7个重要基因: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nr5a2, Glis 1, Cebpa。将MEF利用病毒感染方法进行18 sgRNA导入后，与dCas9-SunTag-VP64形成复合体，激活了OG2-MEF中相应内源基因的表达，经过17天的诱导后，成功得到了iPS细胞，并稳定传代，且显示出与胚胎干细胞相同的克隆形态。通过免疫荧光和QPCR，显示得到的iPS表达Nanog, Sox2和SSEA-1，相关干细胞基因表达水平与RI胚胎干细胞相比，均相当或者超过。此部分证明CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统进行内源激活时，能成功实现iPS诱导（图3）。

　　图3. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统同时激活Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nr5a2, Glis 1, Cebpa内源表达时，能成功实现iPS诱导

　　3. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统单独对Sox2基因进行内源激活，也能有效获得iPS

　　 研究者单独选取了能对Sox2进行激活的SgRNA进行iPS诱导，发现在有效激活内源Sox2基因表达的情况下，能成功得到诱导性多能干细胞，并能稳定增殖传代。得到iPS通过体内体外实验，如干细胞基因表达情况检测实验（免疫荧光、qPCR等）、囊胚注射实验等，在囊胚注射实验后，还得到了嵌合体小鼠，并能稳定地生殖传递，后代中得到OG2小鼠品系的小鼠。这些实验证明了iPS细胞系的完整干性：稳定自我更新能力和多向分化能力（图4）。

　　 图4. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统单独激活Sox2内源表达时，能成功实现iPS诱导

　　4. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统同时对Oct4基因启动子区和增强子区进行内源激活，能有效获得iPS

　　 接下来，研究者选取靶标位置为Oct4启动子区或者增强子区的sgRNA进行诱导实验，发现单独利用Oct4启动子区的sgRNA或者增强子区sgRNA对Oct4基因进行激活时，虽然表达激活，但内源强度无法得与胚胎干细胞系R1相比。在诱导过程中，单独的sgRNA无法得到iPS。Oct4启动子区的sgRNA或者增强子区sgRNA进行组合时，内源Oct4表达强度得到了很好的提升，最终得到iPS，并能稳定增殖传代。得到iPS通过体内体外实验，如干细胞基因表达情况检测实验（免疫荧光、qPCR等）、囊胚注射实验等，在囊胚注射实验后，还得到了嵌合体小鼠，并能稳定地生殖传递，后代中得到OG2小鼠品系的小鼠。这些实验证明了iPS细胞系的完整干性：稳定自我更新能力和多向分化能力（图5）。

　　图 5. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统同时对Oct4基因启动子区和增强子区进行内源激活能有效获得iPS

　　文章小结

　　 作为利用CRISPR-dCas9激活系统进行iPS构建，作者非常有力地证明了CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统对构建iPS的有效性。可以预见，后续的MEF直接诱导形成心肌细胞、神经细胞的研究中，此系统很可能也有一席之地。此文章既进行了相关技术方法探索，也回答了一个非常好的科学问题：iPS诱导过程中，相关内源基因的表观遗传学变化直观重要。

　　在表观遗传学研究中，CRIPSR-dCas9激活内源基因表达的应用，会相对广泛一些。CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系统稍加改进，很可能是直接改变相关基因表观遗传学特征的利器。

　　解析文献

　　P. Liu, M. Chen, Y. Liu, L.S. Qi, S. Ding. CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency, Cell stem cell, 22 (2018) 252-261.

　　参考文献

　　1. Black, J. B., Adler, A. F., et al. (2016) Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells. Cell stem cell 19, 406-414

　　2Chakraborty, S., Ji, H., Kabadi, A. M., et al. (2014) A CRISPR/Cas9-based system for reprogramming cell lineage specification. Stem cell reports 3, 940-947

　　3. Chavez, A., Scheiman, J., et al. (2015) Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature methods 12, 326-328

　　4. Thakore, P. I., D'Ippolito, A. M., et al. (2015) Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature methods 12, 1143-1149

　　5. Buganim, Y., Faddah, D. A., et al. (2012) Single-cell expression analyses during cellular reprogramming reveal an early stochastic and a late hierarchic phase. Cell 150, 1209-1222

　　6.Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676

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