DNA序列的正确测定，是进行基因结构和功能分析，绘制基因图谱、转基因检测等方面工作的重要前提。同时DNA测序技术为快速、简捷分析蛋白序列及结构提供了工具。

DNA序列测定技术是在DNA内切酶、合成酶的应用，基因克隆及亚克隆技术，高分辨率聚丙烯酰胺变性胶电泳技术等基础上建立起来的。这些技术主要有三部分组成，首先为通过各种酶的应用和克隆技术获得一组有相同起点端而终止端在长度上相差一个核苷酸的DNA片段群。其次为通过聚丙烯酰胺凝胶变性电泳，将以上在长度上差一个核苷酸的DNA片段群相互分开。最后是通过放射自显影或化学方法将经变性电泳分开的DNA片段显色。

目前研究人员获得一端相同、另一端差一个核苷酸的途径，主要是采用Sanger(1977)的酶促合成法或Maxam和Gilbert(1977)的化学降解法。在酶促合成法中，人们将待测序列的DNA片段作为模板，以与模板3'端相配对的寡聚核苷酸作为引物，利用Klenow片段、测序酶、Taq酶及AmpliTaq酶等DNA合成酶扩增与模板配对的DNA片段，在扩增过程中，同时进行四组平行实验，每一组中含四种dNTP,和一种ddNTP，这样经过一段时间的扩增，即可获取分别以Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。在化学降解法中，人们用专一性作用于A,T,G,C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。在以上两种方法中，除了要研究与DNA的高级结构、DNA－蛋白质结构相关性有关的序列分析时，采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，研究人员用得较普遍的是酶促合成法，在这种方法中，可测DNA片段长度及正确性与所选用的合成酶类型关系极大(详见附表)。在测序工作的早期阶段，人们只能对ssDNA进行测序，因此在进行测序前，必须将待测片段克隆到M13嗜菌体等中，将dsDNA变成ssDNA，并同时使模板量扩增，然后再测序。而近阶段，随着PCR技术的发展，人们可以利用耐热性Taq酶，采用不对称PCR技术，对待测片段在体外完成单链片段的富集和模板扩增，从而可直接测定dsDNA序列。在酶促合成法测序中，影响测序正确性的另一重要因素为引物的选用，实验中所使用引物一般有特异性引物和通用性引物，前者指当待测片段一端的数十个核苷酸序列已知时，即可人工合成与其相配对的一段寡聚核苷酸作为引物。后者为待测片段末端序列未知，但其末端侧翼有通用型载体片段，且此载体片段为某一内切酶的酶切片段，此时即可选用与此片段配对的商品化通用型引物；另外当待测片段侧翼无载体片段时，人们也可通过DNA联接酶和内切酶的协同使用，在其末端添加上与通用型引物配对的一段寡聚核苷酸。引物的具体要求可参考附录。模板的质量及数量也是影响测序结果的一个重要因素。

测序胶是影响测序质量(包括可读性、可读长度、可重复性等)的又一重要因素。不管是酶促合成还是化学降解得到的不同长度核苷酸片段，都必须通过测序胶来区分并显示。一般通过测序胶可读取300-400核苷酸的可靠序列，但如果在相邻样槽中进行时间梯度电泳，即可最多读取500以上核苷酸的序列。测序胶的一些参数影响着测序结果，具体为：

１：胶浓度

高浓度(12-20%)的胶适合读取引物5'端50个核苷酸以内的序列。

低浓度(６％及以下)的胶可读取5'端400以内或更远的核苷酸序列。

２：胶长度 40-50cm

３：胶厚度 0.4mm。小于此，胶上条带分辨效果好，但极难操作，极易破裂；大于此，条带分辨率下降，且胶难固定和干燥。另外，如采用上薄下厚的胶可改善条带上紧下疏的现象。

４：缓冲液 如配胶缓冲液采用梯度性，也可改善条带上紧下疏的现象。

５：胶板温度：要求整个胶板温度均一，保持在50℃上下，以防止DNA形成链间配对，

经胶分离后条带的显色，主要有同位素标记和非放标记两种。从该技术诞生到现在，基本上都采用对核苷酸进行同位素标记，然后放射自显影，不过，现在在标记物选用上多用35S替代32P。考虑到同位素标记的传统测序使用限制了许多研究人员的工作。目前国外一些公司开发出了一些非同位素测序方法。如银染测序法或地高辛标记探针测序法等。本实验即采用银染法进行DNA序列测定。以使学员对测序技术有一初步了解。PCR测序优点在于１)选用耐热性和热稳定性好的Taq酶，采用不对称PCR直接对dsDNA片段测序。在PCR过程中采用较高的复性温度，增加了引物与模板的特异性结合；较高的延伸温度，防止了DNA二结结构的形成。这些保证了结果的正确性和可重复性。2)需用模板量少，ng-μg级即可。以PCR反应为基础的龈染测序有PCR测序的优点，有不用同位素标记的长项，但也有无法克服的缺陷1)模板及引物纯度要求极高，PCR反应的参数要求较严；2)电泳后步骤要求比较严，略有差错，实验将全盘失败;3)，实验对化学试剂及水的质量要求极高，实验结果与操作经验的相关性极大。