原位杂交试验的跟踪介绍

　　收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成）

　　原位杂交第一天

　　1、重新水化和固定

　　1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。

　　2） 置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟

　　3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次

　　4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟

　　5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

　　蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

　　1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

　　2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。

　　3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。

　　4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

　　2、预杂交

　　1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

　　2）用等体积的HYB+取代HYB－。

　　3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

　　3. 杂交

　　1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..

　　2）60℃ 温浴过夜。

　　注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

　　原位杂交第二天

　　1）将探针回收，放于－20C保存（通常探针可重复使用十次左右）。

　　2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。

　　3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。

　　4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。

　　5）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。

　　6）室温下加1ml 1：2：7溶液，时间为一小时。

　　7）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。

　　原位杂交第三天

　　1） 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。

　　2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。

　　3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。

　　4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色

　　5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。

　　6）4C冰箱保存。