应用MTT比色法检测TNF的生物活性
实验概要
TNF包括TNFα与TNFß两型，它们具有极其相似的生物学活性，在体内外可对一些肿瘤细胞或细胞系起杀伤作用，而对正常细胞则无细胞毒效应。根据这一特点，可利用TNF对敏感靶细胞的细胞毒效应，在体外检测TNF的活性水平，既可检测分泌型TNF(sTNF)，也可检测膜结合型TNF(mTNF)。最常用的方法是体外检测TNF对小鼠成纤维瘤细胞(L929细胞)的细胞毒效应。本实验应用MTT比色法对TNF的生物活性进行了检测。
实验步骤
1. 取对数生长期的L929细胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗涤细胞2次，以去除消化液及原生长培养液；
2. 用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml；
3. 将上述细胞悬液加至96孔培养板，100 ul/孔；
4. 置37℃，5% CO2培养箱中培养24h；
5. 吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测样品，100ul/孔，各设双复孔，并设培养液阴性对照及空白对照(即L929细胞、标准品及待测样品均不加入，仅加培养液)；
6. 同时向各孔均加入10ul放线菌素D(0.5～1μg/孔)；
7. 置37℃，5% CO2培养箱中培养12-14h；
8. 直接于每孔中加入MTT溶液，10μl/孔，37℃孵育4h；
9. 从每孔中轻轻吸出培养上清液100μl/孔，弃去，再于每孔中加入酸化异丙醇或DMSO，100μl/孔，混匀，置室温10min；
10. 用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm分别测各孔OD值。
注意事项
1. L929细胞要充分洗涤，以去除原培养液，同时应均匀分布于各孔中，以免影响检测结果。
2. L929细胞不宜生长过密，只要孔内长成单层即可使用。
3. L929细胞存活率应＞95%。
4. L929细胞随着传代或受其他因素影响，对放线菌素D的敏感性会有差异，应先作预试验确定其使用浓度。
5. 倍比稀释TNF标准品和待测样品时，应以1:2开始至少6个稀释度。
6. MTT染色，其着色深浅不但与细胞数有关，还与细胞激活有关。如某种因素激活细胞后，其代谢率将增强，线粒体琥珀酸脱氢酶活性亦增强，着色也将加深。因此MTT染色时，应考虑待测样品中是否含有能激活靶细胞的因素存在。
7. 加入酸化异丙醇后，应在1h内测定各孔OD值。
8. 本法亦可适用于待测细胞mTNF的检测。
