基因技术专题-1
专题一：RNA干扰技术（RNAi）
1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年， Andrew Fire的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNA interference,RNAi）。随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在于线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也成功阻断了基因的表达，实现了细胞水平的基因敲除。近几年来RNAi的研究取得了很大进展，它被《Science》杂志评为2001年的十大科学成就之一。2002年RNAi的研究又有了新的突破，发现它在基因表达调控中发挥重要作用，它也名列2002年《Science》杂志评的十大科学成就之首。
一. RNAi的机理
目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
1、 参与RNAi反应的酶
RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。Dicer酶广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物体内。它的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断，称为siRNA（short interference RNA），它启动了细胞内的RNAi反应。
由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统。研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。
2、 RNAi的反应过程
双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。
二. 哺乳动物细胞中的RNAi
在小鼠的胚胎细胞中也存在RNAi，将727个碱基对的双链RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞，诱发了细胞内的RNAi机制，并抑制了报告基因的表达。但大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后，会非特异的阻断基因的表达。这是由于当长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活。细胞内干扰素产生增加，蛋白激酶PKR激活，使转录因子E2F被抑制，非特异的阻断基因的转录，并诱导细胞凋亡。另一方面，RNA酶L(RNase L)被激活，产生非特异的mRNA降解。而未分化的胚胎细胞中，上述防御病毒的机制存在缺陷，因而双链RNA能特异的阻断基因的表达。
由于大于30个核苷酸的双链RNA非特异的阻断哺乳动物成体细胞中的基因表达，RNAi在哺乳动物成体细胞中的应用受到限制。但Tuschl等人的研究工作克服了这一障碍。他们发现，21个核苷酸的双链RNA能够诱发哺乳动物细胞内的RNAi机制，同时不会激活细胞内的干扰素。他们合成了以荧光素酶的mRNA为靶分子的21个核苷酸的双链RNA，将它和荧光素酶的表达质粒用脂质体共转染到NIH3T3,COS-7,Hela S3,293细胞中，报告基因的表达被抑制了90%。由于报告基因得到的结果不能完全说明细胞内的情况，他们又合成了细胞内源性基因laminA/C为靶目标的双链RNA，这个双链RNA也特异的抑制了laminA/C的表达，抑制率达到90%以上。
根据一条mRNA的不同靶位点可以合成出许多条双链RNA，研究发现这些双链RNA的作用差别很大。其中转录起始位点，编码区的3’末端为靶点的双链RNA的效果很差。而GC含量低的区域似乎双链RNA的效果好。线虫内的siRNA可以作为引物，以靶mRNA为模板，在RDRP及Dicer的作用下，大量扩增siRNA。将siRNA的3’末端标记上FITC使它丧失引物的作用，在将其转入哺乳动物细胞内，它抑制靶基因的作用并没有受到影响。因而研究者推测，哺乳动物细胞内不存在象线虫那样的依赖于RDRP的RNAi放大机制。在哺乳动物细胞中瞬时转染dsRNA后，dsRNA的作用只维持了三天。而将表达dsRNA的载体转入哺乳动物细胞后筛选出的稳定表达株中，在转染八周后dsRNA仍能有效的抑制靶基因的表达。利用载体表达出的dsRNA为发夹结构，其环状部位的核苷酸的序列和数目对dsRNA的作用都有影响，研究者发现9个核苷酸比5个或7个核苷酸的效果好。DsRNA的作用很强，在1nM时就能有效的阻断靶基因的表达。RNAi还具有很高的特异性。19个核苷酸的dsRNA几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了，这对dsRNA的应用是非常重要的，这可以避免dsRNA降解与靶mRNA同家族的其他的mRNA。
三. 双链RNA的构建
双链RNA可先在体外构建好，然后转染细胞。在体外构建双链RNA时，分别在体外转录出正义和反义RNA，再将两者退火，形成双链RNA。体外合成的双链RNA可以用脂质体转入细胞中。但有些细胞脂质体转移效果差，转移到细胞内的双链RNA半衰期短。而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。
在构建双链RNA的表达载体时，使用RNA多聚酶Ⅲ来指导RNA的合成。这是因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，而且合成出的RNA不会带有polyA尾。当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，它指导的转录就会终止，并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来。U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别， 合成出RNA。ShiYang等人用Bluescript作为载体，U6作为启动子，从绿色荧光蛋白（GFP）的基因上选择了一个21个核苷酸的片断（片断1），将其插入到Bluescript载体中。然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2。他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA。片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止。而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA,因而有利于双链RNA诱发RNAi。
RNA多聚酶Ⅲ还能识别H1-RNA 启动子。在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA。
T7也可作为启动子合成dsRNA。将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体。用此载体可先在体外合成dsRNA,或将其转入到细胞内合成dsRNA。在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶。
双链RNA只能短暂抑制哺乳动物细胞的基因表达。而具有发卡结构的双链RNA能够增加阻断基因表达的时间。在小鼠畸胎瘤细胞，胚胎干细胞，C2C12细胞中，用长链具有发卡结构的双链RNA有效的阻断了报告基因的表达，在稳定表达具有发卡结构的双链RNA的细胞株中，报告基因的表达被长期的阻断了。
腺病毒是体内转基因的常用载体。Xia HaiBin等用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA,并成功的阻断了基因的表达，从而实现了成体动物的基因敲处。
四. RNAi的应用
1. 高通量的研究基因功能
在后基因组时代，需要大规模高通量的研究基因的功能，由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，因而RNAi成为研究基因功能的很好的工具。研究者将线虫三号染色体上2232个基因对应的dsRNA合成出来，并注射到线虫性腺内，然后观察子代细胞分裂时出现的异常表型，结果发现了133个基因与细胞分裂异常有关。其中104个基因以前没有发现有这种功能。在另外一项研究中，线虫一号染色体上的2416个基因对应的dsRNA被构建到细菌文库中，然后将细菌喂给线虫，观察形态学的异常，异常的运动，性别比例的变化，不孕的情况，结果将于这些表型有关的基因从70个增加到178个。
2. 基因敲除
在线虫的体内外试验中，RNAi都能达到基因敲除的结果，从而成为研究这些基因功能的良好工具。对于哺乳动物，RNAi能在体外培养的细胞达到基因敲除的效果，对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。在线虫体内，胰岛素和受体结合后可以活化DSOR1,它是MEK的类似物，DSOR1活化后可以激活ERKA,它是ERK的类似物。用以DSOR1为靶目标的dsRNA可以阻断DSOR1的表达，虽然总的ERKA的表达不受影响，但由于DSOR1的表达被抑制，因而胰岛素刺激后ERKA不能活化。RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。
3. 基因治疗
目前抑制基因表达常采用反义技术或转入没有功能的突变体与该基因竞争。这两种方法对基因表达的抑制都不如RNAi高效特异持久。作为基因治疗的工具，RNAi既高效特异，又简便易行。RNAi在某个基因表达异常增高引起的疾病中会非常有用，如病毒感染，肿瘤等。CDK-2是调控细胞周期的一个关键基因，用以CDK-2位靶目标的dsRNA能阻断99.7%的细胞中CDK-2的表达，而在对照中只有0.2%的细胞中CDK-2基因的表达降低[10]。因而，以CDK-2位靶目标的dsRNA能治疗细胞异常增殖相关的疾病，如肿瘤等。DsRNA还可以抗病毒治疗。研究者们将HIV-1编码rev的基因和与它同源的双链RNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制。CD4基因编码细胞表面HIV病毒的受体，用针对CD4的dsRNA能将细胞表面HIV病毒的受体表达减少75%，从而抵抗HIV病毒的感染。
4. 基因表达调控
今年研究者发现RNAi在Epigenetics中发挥重要作用。Epigenetics是指至少一代的基因表达的改变，而基因的编码没有改变。今年研究者发现，epigenetics调控的一种类型是染色体的改变。通过改变染色体的形状（更紧或是更松），能够决定那一个基因表达。但什么促进了染色体形状的改变以前并不清楚。今年研究者发现，siRNA在染色体形状的改变中起着非常重要的作用。这样RNAi能永久的关闭基因的表达，而不仅仅是短期的抑制它。通过在发育过程中关闭或开放基因的表达，siRNA可能指导着细胞的定向分化。RNAi已被证实能引导植物干细胞的分化，因而研究者认为RNAi也可能参与指导人的干细胞的分化。由于RNAi在基因表达调控中发挥重要的作用，对RNAi微小的干扰就可能导致肿瘤的发生。
目前RNAi在非脊椎动物如线虫，果蝇，以及植物中的应用已经取得了很多重要的成果，但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段。在哺乳动物细胞中，RNAi并不能完全阻断基因的表达，特别是表达异常高的基因。Tuschl等人的研究工作中，有三个基因被抑制了90%，但有一个基因没有被抑制，这就是一个表达很高的基因。另外，运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈，如何将双链RNA高效特异的转入体内仍是一个难题。目前已能用腺病毒作为载体在体内实现RNAi,但仍需要寻找更为安全有效的载体。
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技术原理
