用甲酰胺从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA

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用甲酰胺从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA

2019.9.12

实验方法原理	本方案是 Kupiec 等所述方法（1987) 的改良版本，包括用蛋白酶 K 消化细胞和组织，用高浓度甲酰胺分离 DNA-蛋白质复合物（染色质用火棉胶袋充分透析去除蛋白酶和有机溶剂等过程。甲酰胺是一种离子化溶剂，能分离蛋白质-DNA 复合物并使蛋白变性和释放，但他并不明显影响蛋白酶 K 的活性。用本程序制备的基因组 DNA 很大 7200 kb，适于用高包装容量载体构建文库及通过脉冲凝胶电泳分析大片段 DNA。本方法有两个缺点：比其他方法需要更多的时间；所制备 DNA 的最终浓度颇低（约 10 μg/ml )。从 1X10⁸ 培养的非整倍体哺乳类细胞（如 HeLa 细胞）中大约可制备 1 mg 高分子质量 DNA。
实验材料	λ 噬菌体的线性单体和多联体哺乳类细胞新鲜组织血样
试剂、试剂盒	透析缓冲液甲酰胺变性缓冲液 TE
仪器、耗材	脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶带有不锈钢杯的搅拌器火棉胶袋尖头去除的黄色尖头透析管夹玻璃棒水浴或孵箱
实验步骤	一、材料 1. 缓冲液和溶液透析缓冲液 1（20 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，0.1 moI/L NaCl，10 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，制备 6 L 透析缓冲液 1，储于 4℃。）透析缓冲液 2（10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，10 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，制备 6 L 透析缓冲液 2，储于 4℃。）甲酰胺变性缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0)，0.8 mol/L NaCI，80% (V/V) 甲酰胺） TE ( pH 8.0) 2. 凝胶脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶 3. 核酸和寡核苷酸 λ 噬菌体的线性单体和多联体 4. 专用设备带有不锈钢杯的搅拌器（用于组织）火棉胶袋尖头去除的黄色尖头透析管夹玻璃棒预置于 15℃ 的水浴或孵箱预罝于 50℃ 的水浴 5. 细胞和组织单层或悬浮培养的哺乳类细胞，或新鲜组织，或血样二、方法 1. 采用方案 1 步骤 1~4 制备细胞悬液（或冰冻细胞粉末）的裂解液。 2. 将含有裂解细胞和裂解缓冲液的溶液冷却至 15℃。每 1 ml 细胞裂解液加 1.25 ml 甲酰胺变性缓冲液，用玻璃棒温和地混匀溶液。将溶液在 15℃ 放置 12 h。 3. 将黏滞的溶液灌入一个或者多个火棉胶袋中。透析袋开口用透析管夹封住，在 4℃ 于 2 L 裂解缓冲液 1 中透析 45 min。换新鲜缓冲液 1 并继续透析至少 4 h 后，再换 2 L 新鲜透析缓冲液 1 透析另外 4 h。将 DNA 在 2 L 新鲜透析缓冲液 2 中透析 3 次，每次至少 4 h。 4. 测定 DNA 的浓度。 5. 脉冲凝胶电泳或者常规的 0.6% 琼脂糖凝胶电泳。用 λDNA 单体或者线性多联体作为分子质量标记。基因组 DNA 大小将超过 200 kb。展开

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周锦帆

原国家质检总局教授

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