二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶实验
分光光度法
Stopped 实验
| 实验方法原理 |
|
|---|---|
| 实验材料 | 酶样品 |
| 试剂、试剂盒 | Tris-HCl CoA 乙酰磷酸 磷酸转乙酰酶 DL-二氢硫辛酰胺 |
| 仪器、耗材 | 分光光度计 |
| 实验步骤 |
实验所需「试剂」具体见「其他」 0.98 ml 实验混合物
0.02 ml 酶样品 30℃ 时，于 240 nm 处吸收值发生变化，需使用石英比色皿。
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| 注意事项 | |
| 其他 |
试剂 0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.6 0.01 mol/L CoA（游离酸，Mr＝767.5，CoA·Li3，Mr＝785.4；23 mg 溶于 3 ml 水中） 1.0 mol/L 乙酰磷酸（LiK 盐，Mr＝184.1；1.84 g 溶于 10 ml 水中） 磷酸转乙酰酶（乙酰-CoA：正磷酸转乙酰酶，4000U/ml） 0.2 mol/L DL-二氢硫辛酰胺（50 mg 溶于 1.25 ml 乙醇）。氧化型 DL-硫辛酰胺是可以购买到的（DL-6，8-硫辛酰胺，Mr＝205.3），还原反应可以在 Reed 等（1958）的方法下进行。0℃ 时，2 g DL-硫辛酰胺悬浮于 40 ml 乙醇和 10 ml H2O 中。在 2 h 内连续地缓慢加入 2 g NaBH4，溶液必须呈无色，如果必要的话可多加一些 NaBH4。用 5 mol/L HCl 使溶液酸化，并且试剂是用 20 ml 三氯甲烷提取三次得到的。结合三氯甲烷的相用水洗三次，然后真空干燥。干燥的粉末溶于 5 ml 的热苯（或甲苯）中逐滴加人石油醚，直到出现了稳定的浑浊。在冷室中过夜，就可以形成晶体了。再结晶过程应该重复两次，终产物必须呈白色。
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